裘纪莹　陈相艳　吴发萍　刘孝永　周庆新　王军华　王未名　陈蕾蕾

摘要：研究了解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵产胞外抗菌物质的发酵条件，以无菌发酵液对西瓜枯萎病菌的抑菌圈直径为指标，探讨了发酵温度、装液量、接种量、摇床转速和发酵时间对发酵液抑菌活性的影响。通过单因素试验、Plackett-Burman设计及Box-Behnken响应面法优化并确定了最佳发酵条件为发酵温度为33.82℃，接种量为4.06%，摇床转速为152.46 r/min，装液量为100 mL/250 mL三角瓶，发酵时间为6 d。在最适发酵条件下预测无菌发酵液的抑菌圈直径为25.65 mm，优化后的发酵条件大大提高了发酵液的抑菌活性。

关键词：解淀粉芽孢杆菌；抗菌物质；Plackett-Burman设计；响应面法；发酵条件优化；抑菌活性

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0311—04

解淀粉芽孢杆菌是一类重要的生防菌，能够分泌脂肽、抗菌蛋白及类细菌素等抗菌物质。目前关于解淀粉芽孢杆菌抗菌活性的研究比较热门，如张宝研究了解淀粉芽孢杆菌K103所产脂肽的分子结构、生化特性、抗菌机理及植物生防作用；赵东洋研究了解淀粉芽孢杆菌SWB16菌株脂肽类代谢产物对球孢白僵菌的拮抗作用；安俊莹等采用响应面法优化了解淀粉芽孢杆菌ZJHD-06产类细菌素的发酵培养基；陈召亮等研究了解淀粉芽孢杆菌RY3产抗菌粗蛋白的理化性质及其对柑橘绿霉病菌的抑菌活性；蔡文韬等研究了解淀粉芽孢杆菌发酵液对提高辣椒采后品质的影响。

解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7是笔者所在实验室自行筛选的1株广谱拮抗菌株，对包括西瓜枯萎病菌、枣炭疽病菌、苹果斑点落叶病菌和轮纹病菌、梨黑斑病菌、青霉病菌等典型果蔬病原真菌以及金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等病原细菌有很好的抑制作用。同时，有研究表明，该菌产胞外抗菌物质对采后苹果轮纹病具有良好的防治作用，防治效果与纳他霉素相当，对梨采后青霉病的防治也有明显效果，因此具有比较好的开发应用价值。在此基础上，本研究采用单因素试验、Plackett-Burman设计和响应面法对该菌产胞外抗菌物质的发酵条件进行了优化，从而提高了发酵液的抑菌活性。

1材料与方法

1.1菌种

解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7，由笔者所在实验室分离；西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.niveum），由山东大学微生物技术国家重点实验室惠赠。

1.2材料与试剂

牛肉膏蛋白胨培养基用于NCPSJ7菌株的培养和保存；PDA培养基用于病原菌的培养、保存和牛津杯法测定抑菌活性；发酵培养基用于拮抗菌胞外抗菌物质的发酵，具体配方为葡萄糖5 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，（NH₄）₂SO₄ 5 g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH值7.0。其他试剂均为分析纯。

1.3仪器与设备

CR22Gm高速冷冻离心機（日本日立公司）；霉菌培养箱LRH-150-MS（广东省韶关市泰宏医疗器械有限公司）；生化培养箱SHP-150（上海精宏试验设备有限公司）；ZWY-2102恒温摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）。

1.4试验方法

1.4.1无菌发酵液的制备 菌种活化及种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7接种于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24 h。挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180 r/min摇床培养24 h，得种子液。发酵：将种子液按一定比例接种于发酵培养基，在一定的装液量、摇床转速和发酵温度条件下摇床培养一定时间，既得NCPSJ7发酵液。无菌发酵液的制备：将发酵液于4℃、10 000 r/min离心20 min，弃菌体保留上清液，用0.45μm滤膜过滤，即得无菌发酵液。

1.4.2抑菌活性检测 按文献报道的方法，略有改动。病原指示菌菌悬液制备：将西瓜枯萎病菌活化后接种于PDA平板，按文献报道的方法制成孢子菌悬液，4℃保存，备用。抑菌活性的检测：取50μL的病原指示菌菌悬液均匀涂布于PDA平板培养基上，待干后在平板中央放置1个无菌牛津杯，向杯中加入200μL无菌发酵液，于28℃培养3 d，测定抑菌圈直径。

1.4.3单因素试验 以无菌发酵液对西瓜枯萎病菌的抑菌圈直径为指标，分别考察培养温度、装液量、接种量、摇床转速和发酵时间对无菌发酵液抑菌活性的影响，每组3个平行。

1.4.4 Plackett-Burman设计 在单因素试验的基础上，利用minitab软件创建一个Factors=5、Runs=12的Plackett-Burman设计表，每个因素选取2个水平，低水平为单因素最佳培养条件，高水平为低水平的1.09～1.25倍，然后按设计开展试验，考察各试验因素的重要性。

1.4.5响应面法优化 采用Box-Behnken法，对Plackett-Burman试验筛选出的较显著因素进行进一步优化，每个因素选取3个水平，利用Design Expert 8.0软件进行响应面及方差分析，并对数据进行二次回归拟合，得到多元回归方程，在一定水平范围内求取最佳值，对发酵条件进行优化。

2结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1发酵温度对无菌发酵液抑菌效果的影响 在31～43℃之间选取5个不同水平的发酵温度进行试验，结果如图1所示。发酵温度34℃时，无菌发酵液的抑菌圈直径最大，即抑菌活性最强。

2.1.2装液量对无菌发酵液抑菌效果的影响 5个水平装液量对抑菌效果的影响结果如图2所示。发酵培养基的装液量为100 mL/250 mL三角瓶时，无菌发酵液的抑菌圈直径最大，即抑菌活性最强。

2.1.3摇床转速对无菌发酵液抑菌效果的影响 5个不同水平的摇床转速对抑菌效果的影响如图3所示。摇床转速为150 r/min时，无菌发酵液的抑菌圈直径最大，即抑菌活性最强。

2.1.4接种量对无菌发酵液抑菌效果的影响 不同的接种量对抑菌效果的影响结果如图4所示。接种量为3.0%时，无菌发酵液的抑菌圈直径最大，即抑菌活性最强。

2.1.5发酵时间对无菌发酵液抑菌效果的影响 不同发酵时间对抑菌效果的影响结果如图5所示。随着发酵时间的延长，无菌发酵液的抑菌效果也随之增强，当发酵6 d时，无菌发酵液的抑菌效果最好，之后抑菌效果呈下降趋势。

2.2 Plackett-Burman试验筛选显著因素

在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman设计显著因素筛选方案，对5个因素进行考察。各因素的参数、水平见表1，试验设计与测定结果见表2。

对上述结果进行t检验和方差分析，结果（表3）表明，置信度大于95%的因素被认为是显著因素。可见，5种因素影响的显著性顺序为发酵温度>接种量>摇床转速>发酵时间>装液量。发酵温度和接种量对无菌发酵液的抑菌活性具有显著影响，摇床转速的影响虽不显著，但影响也较大，作为进一步优化的因素。装液量和发酵时间对结果的影响较小，选取单因素试验中的最适值：装液量100 mL/250 mL三角瓶，发酵时间6 d。

2.3响应面分析法优化发酵条件

选取对无菌发酵液抑菌活性影响较大的3个因素（发酵温度、接种量和摇床转速）进行Box-Behnken響应面法优化，其编码水平见表4，试验设计与测定结果见表5。

通过上述多元回归方程作3组响应面和等高线图，结果见图6。由图6-a可以看出，当发酵温度由低到高逐渐变化，接种量也由低到高逐渐变化时，抑菌圈直径呈现先上升后下降的趋势；由图中等高线形状接近圆形可知，发酵温度和接种量对抑菌圈直径影响的交互作用不显著。由图6-b可以看出，当发酵温度由低到高逐渐变化，摇床转速也由低到高逐渐变化时，抑菌圈直径呈现先上升后下降的趋势；由图中等高线形状接近圆形可知，发酵温度和摇床转速对抑菌圈直径影响的交互作用不显著。由图6-c可以看出，当接种量由低到高逐渐变化，摇床转速也由低到高逐渐变化时，抑菌圈直径呈现先上升后下降的趋势；由图中等高线形状接近圆形可知，接种量和摇床转速对抑菌圈直径影响的交互作用不显著。

2.4模型验证试验

根据响应面优化回归方程求得解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵产胞外抗菌物质的最适发酵条件为发酵温度33.82℃，接种量4.06%，摇床转速152.46 r/min，装液量100 mL/250 mL三角瓶，发酵时间6 d，预测的最大抑菌圈直径为25.65 mm。

为了方便试验，选取发酵温度34℃、接种量4.06%、转速155 r/min、装液量100 mL/250 mL三角瓶、发酵时间6 d，作3组平行，进行验证试验。结果抑菌圈直径的平均值为25.30 mm，接近预测值，说明该模型能够较好地预测发酵液抑菌活性情况。

3讨论与结论

本试验对解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产胞外抗菌物质的发酵条件进行了优化。首先采用单因素试验优化了发酵温度、装液量、接种量、摇床转速和发酵时间这5个因素，在此基础上采用Plackett-Burman设计筛选出发酵温度、接种量和摇床转速这3个较显著因素，然后通过响应面法研究了各显著因素及其交互作用对发酵产抗菌物质的影响。通过对试验结果进行分析，建立了解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7无菌发酵液的抑菌圈直径与发酵温度、接种量和摇床转速这3个较显著因素的多项式模型，并确定了最适发酵条件：发酵温度33.82℃，接种量4.06%，摇床转速152.46 r/min，装液量100 mL/250 mL三角瓶，发酵时间6 d，预测的最大抑菌圈直径为25.65 mm。同时验证试验结果表明试验值与预测值接近，说明该模型能够较好地反映实际发酵情况，可用于预测发酵液抑菌圈直径与发酵条件的关系。

对于拮抗菌NCPSJ7，本试验只是从发酵条件方面进行了优化，培养基的组成、发酵液中主要抗菌物质的组成、分子结构等均未进行研究。同时如果能够对发酵过程中产生抗菌活性物质的中间代谢产物、关键酶等进行调控，或者将菌种进行基因改造，将有望获得更高的抑菌活性，这对拮抗菌剂的产业化生产和应用具有重大意义。