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臭常山理化特征及其脂溶性生物碱的提取工艺

2017-05-17吕庆银赵伟李岑李雄张振

江苏农业科学 2016年1期
关键词:指纹图谱正交试验

吕庆银 赵伟 李岑 李雄 张振

摘要:先对臭常山的水分、总灰分、醇浸出物及其TLC、HPLC指纹图谱进行研究,明晰试验药料的理化特征,然后采用超声波辅助乙醇提取法对臭常山脂溶性生物碱的提取工艺进行正交优化。结果表明,本试验材料臭常山的水分、醇溶性浸出物、总灰分含量分别为8.21%、6.22%、6.20%;在单因素的基础上,正交试验确定的最佳提取工艺条件为臭常山粗粉400 g,料液比1 g:20 mL,65%乙醇超声提取80 min/次,超声提取3次,脂溶性生物碱的提取率为0.385%。

关键词:臭常山;指纹图谱;脂溶性生物碱;正交试验

中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1002—1302(2016)01—0279—04

芸香科(Rutaceae)臭常山属臭常山(Orixa japonica Thunb.),别称日本常山、臭山羊,其主要化学成分为香豆素和喹啉类生物碱。目前关于其研究主要集中在所含化学成分方面,现从臭常山的根、茎、叶等部位分离到的已知喹啉类生物碱有:常山碱、香草木碱、茵芋碱、月芸香酮碱、香草木碱、去甲和常山碱、加锡弥罗果碱、花椒毒素等。试验前期研究发现,这些化学成分中的一些喹啉类脂溶性生物碱具有抗肺炎克雷伯氏杆菌及金黄色葡萄球菌等抑菌活性。作为贵州民间中药材,常用来治疗风热感冒、咳嗽、风湿关节痛等病症,其理化特征和提取工艺方面的研究未见国内外文献报道。为富集其有效成分,在对试验臭常山理化特征进行研究后,进行有效成分的提取分离工艺研究,以期明确试验材料的理化特征,并获得脂溶性生物碱的最佳提取工艺途径,为推进臭常山中药现代化研究提供一定的理论基础。

1试验材料

1.1材料与试剂

新鲜植物整株经贵州大学苟光前教授鉴定为芸香科植物臭常山(Orixajaponica Thunb.);色谱乙腈及色谱甲醇(美国天地公司)、超纯水(浙江杭州哇哈哈集团有限公司);蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

1.2仪器和设备

UltiMaterTM3000 DGLC双三元液相色谱仪,富集柱(Ther-mo Fisher HyperSep Retain-CX,20 mm×3.0 mm),DAD检测器,分析柱(Acclaim 120 PAⅡ,C18,5μ×m,4.6 mm×250 mm),以上均为美国Thermo Fisher Scientific公司产品;变色龙7.2工作站;SPJX-4-10型高温箱式电阻炉(上海锦昱科学仪器有限公司);WT5001电子天平(江苏常州万泰天平仪器有限公司);ES-E210B电子分析天平(河南郑州南北仪器设备有限公司);洁康PS-100A超声波清洗机(广东东莞市洁康超声波设备有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵、RE-501升降恒温水浴锅、RE-501型旋转蒸发器及DLSB-10/20℃型低温冷却循环泵(均为上海鹰迪仪器设备有限公司);GF254硅胶板(山东青岛海洋化工厂),ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)。

2试验方法

2.1材料预处理

将新鲜的臭常山整株截短、洗净,然后晾干、粉碎,自然风干后备用。

2.2臭常山水分、总灰分、醇浸出物的测定

水分含量测定采用中国药典一部附录ⅨH水分测定法项下的烘干法;醇浸出物测定采用药典一部附录Ⅹ A项下醇提取物热浸法;灰分测定采用药典附录ⅨK项下的总灰分测定法。

2.3 TLC指纹图谱

准确称取臭常山全株粗粉100 g,以1 g:5 mL的料液比加入70%乙醇,超声提取30 min,过滤,浓缩,吸取少许浓缩液点于硅胶GF254板,以石油醚:丙酮=8:2为展开剂,展开,晾干,于紫外灯(257.5 am)下检视。

2.4 HPLC指纹图谱

2.4.1測试样品制备 准确称取过二号筛的臭常山粉末2.408 9 g,加70%乙醇60 mL置250 mL锥形瓶中,密塞称定质量,静置1 h,然后连接回流冷凝管,并保持微沸1 h,放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,用干燥过滤器过滤,取滤液过0.45μm针头过滤器,即得测试样品。

2.4.2对照品制备分别精确称取月芸香酮碱、香草木碱(实验室自制,纯度>95%),加入甲醇后制成100μg/mL的对照品溶液。

2.4.3色谱条件色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(体积比1:1),体积流量1.00 mL/min,进样量20μL,柱温30℃,检测波长266 nm。

2.5脂溶性生物碱的制备及定量测定

(1)醇粗提物提取。准确称取臭常山粗粉400 g,4层纱布包裹,按试验所需的浓度和料液比加入乙醇进行超声提取,然后过滤,滤渣进行重复提取,滤液浓缩成浸膏,干燥,即得粗提物。(2)脂溶性生物碱的制备和测定。取适量的2%HCl溶解上述浸膏,滤清酸水,等体积的乙酸乙酯萃取酸水3次,弃去乙酸乙酯层,25%氨水调节pH值为9~10,等体积氯仿萃取3次,合并氯仿层,浓缩,回收氯仿,残留物即为脂溶性生物碱,干燥,称质量。

2.6脂溶性生物碱的定性检测

生物碱的定性鉴定方法有很多,本试验采用碘化铋钾显色法和薄层色谱法,具体方法如下:(1)取“2.5”节下制得的脂溶性生物碱3~5 mg,适量氯仿溶解;(2)毛细吸管吸取上述溶液点于硅胶GF254板上;(3)以石油醚-丙酮(8:2)为展开剂展开,取出,晾干,紫外灯(257.5 nm)下检视;(4)喷碘化铋钾显色液,晾干,日光下观察;日光下有多个橘黄色或橙色斑点,紫外灯下有多个荧光亮点,即可判断酸碱处理结合溶剂萃取后得到的是脂溶性生物碱。

3结果与分析

3.1试验用臭常山的水分、总灰分、醇浸出物含量比较

由表1可知,本试验用臭常山的7次测试样品中,最高水分含量和最低水分含量相差0.07百分点,两者相差不到0.1百分点,表明水分含量测定方法重复性良好;总灰分含量最高的为6.30%,最低的为6.11%,两者相差0.19%,这可能是每次取样量的多少不同,导致需要高温炽灼的次数不同,而测试的精确度只需到0.01g,所以操作误差相对会变大,试验重复性差些;70%醇浸出物含量最高的为6.27%,最低的为6.11%,两者相差不到0.2百分点,醇浸出物含量测定稳定性和重复性良好。

3.2指纹图谱

3.2.1 TLC指纹图谱 按上述“2.3”节的条件,毛细管分别吸取3次样品溶液少许,点于同一块GF254板上,对试验材料进行TLC指纹图谱分析,结果(图2)表明,同一样点在以石油醚-丙酮(8:2)为展开剂,经展开后得到了多个荧光点,表明此展开体系适用于本样品的TLC指纹图谱构建;且3次点样得到的显荧光点位置几乎一致,表明试验重复性良好。

3.2.2 HPLC指纹图谱 按上述条件,对试验材料进行HPLC指纹图谱分析。分别吸取对照品和供试品溶液各20μL,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图3至图5。对照品香草木碱和月芸香酮碱的保留时间分别为8 min左右和11.5 min左右,峰分离度好,峰形对称。

3.2脂溶性生物碱提取的单因素试验

3.2.1乙醇浓度对脂溶性生物碱提取的影响 准确称取臭常山粗粉400 g 5份,以料液比为1 g:10 mL,分别加入体积分数为55%、65%、75%、85%、95%的乙醇,超声提取30 min,按“2.5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性和定量测定,考察不同浓度的乙醇对脂溶性生物碱提取率的影响,试验结果见图6。

由图6可知,脂溶性生物碱的提取率在乙醇体积分数为65%时达到最大,当乙醇的体积分数超过65%时,随着乙醇体积分数的增大,脂溶性生物碱的提取率反而随之下降。这可能是因为细胞在超声破碎后,内容物释放到溶液中,脂溶性生物碱与其他内容物之间在这个极性段共溶性较好。以体积分数75%和85%的乙醇作为提取溶剂,脂溶性生物碱的提取率都比55%的大,因此通过此单因素试验,宜选择体积分数65%、75%、85%的乙醇作为正交试验中考察乙醇浓度影响的3个水平。

3.2.2超声提取时间对脂溶性生物碱提取的影响 准确称取5份臭常山粗粉各400 g,在料液比为1 g:10 mL、乙醇体积分数为65%的条件下,分别超声提取40、50、60、80、100 min,按“2.5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性分析和定量测定,考察不同超声提取时长对脂溶性生物碱提取率的影响,结果见图7。

由图7可知,臭常山脂溶性生物碱的提取率随着超声提取时间的延长而增大,但当时间长达80 min时,再延长时间脂溶性生物碱的提取率已变化不大,但超声提取时长100 min,其提取率由80 min的0.288%增加到0.295%,提取率只提高了0.007百分点,分析其可能原因是在超声进行到60 min时,细胞已经开始了大量破裂,细胞中所含生物碱大量释放到提取液中。考虑到工艺要节能省时,故不考察超声提取100 min后继续延长超声提取时长的影响,所以正交试验在考察超声提取时间对脂溶性生物碱提取率的影响时,只需考察60、80、100 min这3个水平。

3.2.3料液比對脂溶性生物碱提取的影响 准确称取5份臭常山粗粉各400 g,在乙醇体积分数为65%的条件下,分别以料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25(g:mL),超声提取60 min,按“2.5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性分析和定量测定,考察不同料液比对脂溶性生物碱提取率的影响,结果见图8。

由图8可知,超声提取过程中,脂溶性生物碱的提取率随着提取过程中乙醇用量的增加而增大,当料液比为1 g:15 mL时,随着乙醇用量的增加,脂溶性生物碱的提取率提高并不大,这是因为大部分细胞已经破碎,细胞中脂溶性生物碱都已释放到溶液中,考虑到乙醇用量的增大会增加耗能和增长旋转蒸发仪减压浓缩浸膏的时间,耗能耗时,不符合工艺优化的目的。因此通过此单因素试验,可以确定正交试验考察料液比对脂溶性生物碱提取率的影响时,料液比的选择范围应在1 g:15 mL左右。

3.2.4超声提取次数对脂溶性生物碱提取的影响 准确称取臭常山粗粉400 g,在料液比为1 g:10 mL、乙醇体积分数65%的条件下,超声提取60 min/次,分别提取1、2、3、4次,按“2.5”节下的方法对各组脂溶性生物碱进行定性分析和定量测定,分别考察超声提取次数对脂溶性生物碱提取效果的影响,试验结果见图9。

由图9可知,随着超声提取次数的增加,脂溶性生物碱的提取率亦在增大,当超声提取进行1次时,脂溶性生物碱的提取率为0.28%,过滤后的药渣进行与第1次相同条件的重复提取,与第2次提取率相比,第3次提高了0.04百分点;第4次比第3次只提高了0.01百分点,所以在优化臭常山脂溶性生物碱提取工艺过程中,在考察了乙醇浓度、超声时间、料液比3个因素的正交试验后,将得到优方案工艺进行检验,最后将优方案工艺进行3次超声提取,即可达到试验的工艺优化研究目的。

3.3脂溶性生物碱提取的正交试验

在考察了上述单因素试验的基础上,臭常山脂溶性生物碱正交试验设计要考察的各因素与水平详见表2,正交试验结果及分析见表3。

从表3可知,影响臭常山脂溶性生物碱提取率的各因素的主次顺序依次为:乙醇体积分数>超声提取时间>料液比,较优方案是用体积分数为65%的乙醇、在料液比1 g:20 mL的条件下超声提取80 min。因为此方案在正交试验中没有,故需进行补充试验进行验证。按照优方案设计试验,超声提取3次,结果得到臭常山脂溶性生物碱的提取率为0.385%。

4讨论与结论

与一般文献报道的生物碱提取工艺不同,由于中药材植物的理化特征容易受到生长地区、季节、年龄的影响,在进行有效成分分离提取工艺前,首先对试验材料臭常山提取液进行HPLC、TLC指纹图谱和水分、总灰分、醇浸出物含量等理化特征研究,其水分、总灰分、醇浸出物含量均值分别为8.21%、6.22%、6.20%,水分含量和醇浸出物含量测定的稳定性和重复性良好,可能是受取样量和试验精度要求的影响,醇浸出物含量测定的稳定性要稍差些。

与关于臭常山所含化学成分的分离鉴定文献报道不同,本研究重点在臭常山的理化特征和脂溶性生物碱的提取工艺,影响其提取因素的顺序依次为:乙醇体积分数>超声提取时问>料液比;正交试验确定的最佳工艺条件为:65%乙醇作为提取剂,料液比1 g:20 mL,超声提取时间80 min,提取3次,脂溶性生物碱提取率为0.385%。富集到的脂溶性生物碱抗肺炎球菌、金黄色葡萄球菌及其他抑菌活性可进行深入研究。

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