胡彦新　李清　王英　刘小莉　董明盛　周剑忠

摘要：从侗族酸肉、贵州酸汤、苗族酸鱼等传统发酵食品中分离63株乳酸菌，通过琼脂扩散牛津杯法从中筛选出M-M₄、SS₂-6、SR₄-1这3株对指示菌均具有明显抑菌作用的菌株。3株菌株经排除有机酸和过氧化氢作用、胰蛋白酶和胃蛋白酶发酵处理、70%硫酸铵沉淀发现，这3株菌株经排除有机酸和过氧化氢作用仍具有一定的抑菌活性；用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理，菌株活性消失；经硫酸铵沉淀的盐析液抑菌能力明显增大。通过形态学观察、生理生化试验和16S rRNA序列分析方法，鉴定这3株菌株分别是香肠乳杆菌、乳酪短杆菌、植物乳杆菌。

关键词：发酵食品；乳酸菌；细菌素；硫酸铵沉淀；筛选鉴定

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0276—03

细菌素是一类在细菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生、具有抑菌活性的蛋白质或多肽，一般只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用，对自己产生的细菌素具有自身免疫性。乳酸菌是公认的安全微生物和益生菌，在许多食品发酵中广泛应用，历史长达几千年。乳酸菌素是乳酸菌产生的一类蛋白类抑菌物质，可以改善肠道生态，对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。目前，研究最为深入的是乳球菌乳酸亚种所产细菌素Nisin，现已被60多个国家广泛应用于乳制品和罐头制品等的保藏。

近年来，发现的新型细菌素种类繁多，但对其进行深入研究的很少，而投入生产的更是少之又少，对新型细菌素的研究和开发显得尤为重要。为获得结构新颖、抑菌活性更为稳定的细菌素，国内外学者从当地传统的发酵食品中，尤其是发酵肉制品中进行产细菌素乳酸菌的分离筛选。如De Carvalho等从意大利Salami香肠中分离到1株能抑制李斯特氏菌的乳酸菌；Noonpakdee等从泰国传统发酵香肠Nham中分离到1株产Nisin的乳酸乳球菌；而我国学者则多从四川腊肉香肠、宣威火腿、泡菜、传统乳制品等发酵食品中分离得到产细菌素的乳酸菌。

本试验以侗族发酵酸肉、贵州酸汤和苗族酸鱼等传统发酵食品中分离出的63株乳酸菌为材料，采用琼脂扩散牛津杯法对产细菌素乳酸菌进行筛选，利用16S rRNA序列分析法进行乳酸菌鉴定，以期从原生态的发酵食品中筛选出有益的乳酸菌，对充分挖掘本地传统发酵食品中的乳酸菌资源具有一定的理论和实践意义，为生鱼保鲜和食品生物防腐提供優质菌种资源。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 63株供试乳酸菌分离于苗族酸鱼、侗族酸肉、贵州酸汤等传统发酵食品中；3种指示菌分别为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmoaella）、志贺氏菌（Shigella），均来源于江苏省农业科学院农产品加工研究所微生物实验室。

1.1.2培养基与主要试剂 培养基主要有MRS培养基、LB培养基、YPD培养基、糖发酵培养基等；胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，均由美国Sigma公司生产；NaOH、HCl，均为分析纯。

1.1.3主要仪器与设备 JY 502电子天平、SX-500型立式电热压力灭菌锅、SW-CJ-2G型双人单面净化工作台、LRH-150型生化培养箱、THZ-98型台式恒温振荡器、SIGMA 3K15高速冷冻离心机、PB-20型pH计、722S型可见分光光度计、85-2型磁力搅拌器、HH-6型数显恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、游标卡尺等。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的活化及发酵上清液的制备 将63株乳酸菌分别接种于液体MRS培养基中，37℃培养16～18 h；传代培养2次，以2%接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h；发酵液经10 000 r/min、4℃低温冷冻离心10 min，收集上清液，置于4℃保存。

1.2.2指示菌的培养及菌悬液的制备 将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌3种指示菌传代1次，保存于4℃冰箱。使用前，将其接种于LB液体培养基，传代2次，每次均于37℃、120 r/min培养16 h。

1.2.3抑菌活性的测定 采用琼脂扩散牛津杯法测定乳酸菌发酵上清液的抑菌活性。将指示菌发酵液用冷却至40～50℃的LB半固体培养基稀释至10⁶～10⁷CFU/mL，倒平板；待培养基凝固，用无菌镊子将灭菌的牛津杯从凝固好的培养基中轻轻拔出；乳酸菌发酵上清液用0.22μm滤膜过滤以去除杂菌；在用牛津杯打好的孔中分别注入150μL发酵上清液和盐析液，4℃冰箱中渗透扩散5 h，37℃培养箱中静置培养24 h，观察并测量抑菌圈大小。设3个平行试验，求均值；下同。

1.2.4有机酸抑菌作用排除试验 将培养好的发酵液，用1 moL/L氢氧化钠溶液调pH值为6.0，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验。

1.2.5过氧化氢抑菌作用排除试验 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将发酵上清液调至过氧化氢的最适作用pH值7.0；将发酵上清液用1 mol/L过氧化氢酶于37℃水浴1 h，将pH值调回对照pH值，以未经酶处理的发酵上清液作为对照，进行抑菌试验。

1.2.6蛋白酶敏感试验 将胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶分别加入试验菌株的发酵上清液中，使其终浓度为1 mg/mL；调节pH值至各酶的最适作用范围，37℃水浴2 h；取出，再将pH值调回至6.0，进行抑菌试验。

1.2.7细菌素的硫酸铵分级沉淀 在等量发酵上清液中分别加入固体硫酸铵，使其饱和度分别为40%、50%、60%、70%、80%，振荡过夜；10 000 r/min、4℃离心10 min，收集沉淀，用pH值为6.0的磷酸缓冲液溶解；离心，超滤浓缩，进行抑菌试验，指示菌为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

1.2.8产细菌素乳酸菌的鉴定 MRS琼脂平板上观察菌落形态，革兰氏染色观察菌体形态；各生理生化指标测定参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》《微生物学实验》及《伯杰细菌鉴定手册》进行，主要包括过氧化氢酶试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇（VP）试验、石蕊牛奶试验、淀粉水解试验、葡萄糖产酸试验和糖发酵试验等；16S rRNA遗传学鉴定方法参照文献[14]进行。

2结果与分析

2.1产细菌素乳酸菌的筛选

通过琼脂扩散牛津杯法确定63株乳酸菌中有24株菌株的发酵上清液对3种指示菌有抑制作用，其中有7株菌株对3种指示菌均具有抑菌作用。由表1可见，筛选出的7株菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相对最好；对3种指示菌抑菌效果较好的菌株有M-M₄、SS₂-6、SR₄-1。

2.2有机酸、过氧化氢作用的排除

由表2可见，排除有机酸、过氧化氢作用，菌株M-M₄、SS₂-6、SR₄-1仍有一定的抑菌作用，说明这3株乳酸菌对指示菌的抑制作用不单纯是由有机酸、过氧化氢引起的，可能由于其在代谢过程会产生其他抑菌物质。

2.3蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质

排除有机酸和过氧化氢对指示菌的抑制作用后，为进一步确定抑菌物质是否具有蛋白质性质，本试验用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶对发酵液进行处理，用其发酵液进行抑菌试验，检测抑菌能力是否降低。结果表明，细菌素对胰蛋白酶、胃蛋白酶特别敏感，其菌株发酵上清液的抑菌效果基本消失；对木瓜蛋白酶、糜蛋白酶则较为稳定，抑菌圈直径没有明显变化。结果说明这2株菌株产生的抑菌物质主要为蛋白质。

2.4硫酸铵沉淀和最佳沉淀浓度的确定

试验结果表明，随着硫酸铵浓度的增加，3株菌株的盐析液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有抑制能力（表3）且逐渐增大，用70%、80%硫酸铵沉淀的盐析液对其指示菌的抑菌能力相差无几。因此，确定硫酸铵沉淀的最佳浓度为70%。

2.5产细菌素乳酸菌的鉴定