陈立华　张月华　钱荷英　孙平江　李刚　徐安英

摘要：将40%辛硫磷原液稀释成35～70 mg/L浓度区间的8个浓度梯度，采用浸叶法测定了辛硫磷对于5龄第3天蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricini）24 h的半致死浓度（LCso），计算出40%辛硫磷乳油对蓖麻蚕的LC₅₀（24 h）为51.81 mg/L。用实时荧光定量PCR（RT-qRCR）方法检测添食50 mg/L辛硫磷后蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因Pcracel、Pcrace2在不同组织（血液、脂肪体、中肠、丝腺、头）中的表达变化，结果显示：在添食辛硫磷之后，Pcracel、Pcrace2在各组织中的表达都有变化，其中Pcracel在头部、脂肪体的转录表达量分别比对照组高10.66、26.50倍；Pcrace2在头部、脂肪体的转录表达量分别比对照组高24.73、14.56倍；Pcracel、Pcrace2表达量在中肠、丝腺中的变化不大，上调的倍数分别是7.65、5.62与3.44、2.34倍；Pcracel、Pcrace2在血液中几乎无表达变化，表达变化倍数分别为2.52、1.11倍。结果表明，Pcracel、Pcrace2主要在脂肪体、头部发挥代谢解毒作用，而中肠、丝腺等组织对农药辛硫磷的代谢解毒作用较小，血液几乎不参与解毒作用。

关键词：蓖麻蚕；辛硫磷；半致死浓度（LC₅₀）；代谢解毒；乙酰胆碱酯酶基因（ace）

中图分类号：S885.22 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0264—03

蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricini）原产于印度，是大蚕蛾科樗蚕的一个亚种，以蓖麻叶、椿树叶及木薯叶为主要饲料，在我国广西、江苏、内蒙以及印度、泰国等东南亚国家进行饲养，是绢丝生产的重要蚕品种之一。辛硫磷是一种以触杀、胃毒为主的高效低毒有机磷杀虫剂，因其具有杀虫广谱性和无内吸作用，广泛应用于小麦、玉米、水稻、棉花、桑树等作物的多种鳞翅目害虫的防治。但是在对木薯、蓖麻等作物害虫进行防治的过程中，由于对药物浓度、残留期等把握不好，蓖麻蚕农药中毒的情况时有发生，导致蚕农养蚕绝收或蚕茧质量、产量下降，养蚕户出现较大的经济损失，成为蓖麻蚕产业发展的阻力。

乙酰胆碱酯酶是昆虫靶标抗性作用靶标之一，为有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶的突变和超表达是昆虫抵抗杀虫剂的重要方法，国内外已有许多相关报道。王举梅等对家蚕添食辛硫磷前后2种乙酰胆碱酯酶基因（ace1、ace2）的转录特征进行了研究，结果表明：在正常的家蚕中，ace1在各组织中表达量差异很大，在脑组织中高量表达，在其他所有组织中只有微弱的表达；而ace2在各组织中的表达量差距不大，在中肠、丝腺和血淋巴中相对表达量较低，在脂肪体、卵巢中相对表达量较高。刘芳等已发现乙酰胆碱酯酶不敏感的果蝇、家蝇、埃及伊蚊等抗性昆虫。目前关于蓖麻蚕在靶标抗性解毒酶分子水平的研究报道很少。本研究根据《化学农药环境安全评价试验准则》推荐的浸叶法测定辛硫磷对蓖麻蚕5龄第3天24 h的半致死浓度（LC₅₀），并采用实时荧光定量PCR（RT-qRCR）方法检测添食辛硫磷后乙酰胆碱酯酶基因在不同组织（血液、脂肪体、中肠、丝腺、头）中的表达变化，以期为蓖麻蚕抗药性研究提供基础，也为害虫的防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与药剂

供试农药：40%辛硫磷乳油，连云港立本农药化工有限公司生产。供试蓖麻蚕品种：海蓝（B7）品种，由中国农业科学院蚕业研究所提供，用常规方法催青，饲养至5龄第3天，选取发育一致的正常蓖麻蚕幼虫个体。供试蓖麻叶：由中国农业科学院蚕业研究所试验场提供，采摘未施用农药的新鲜5龄蓖麻叶。

1.2菌种与试剂

大肠杆菌DH5a感受态细胞，由笔者所在课题组制备。PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ（Tli RNaseH plus）、pMD19-T Simple Vector等，购自大连宝生物工程公司。TRIzol试剂，购自Promega公司。

1.3辛硫磷对蓖麻蚕LC₅₀的测定

采用浸叶法测定辛硫磷对蓖麻蚕5龄第3天24 h的LC₅₀。参照农药公司推荐的使用浓度和预试验测定的24 h蓖麻蚕全部死亡和全部存活的浓度，正式试验在此浓度范围内重新设定浓度，以蒸馏水浸泡蓖麻叶为对照。将40%辛硫磷原液分别稀释成35、40、45、50、55、60、65、70 mg/L，共8个浓度梯度。将蓖麻叶切成1 cm²左右的方片，在辛硫磷配制液中浸泡10 s，自然晾干后供蓖麻蚕食用。采用添食毒蓖麻叶1g/头的标准，取饲养20头5龄第3天蓖麻蚕为1个试验组，每个浓度3次重复，共计60头。将喂食添加辛硫磷农药后的蓖麻蚕置于温度为25℃、相对湿度80%的环境中饲养，24 h后观察并记录中毒情況及死亡数。

采用Abbott公式计算添食辛硫磷后蓖麻蚕的死亡率，当对照组死亡率为0时，试验组死亡率=[（试验蚕数-药后活蚕数）/试验蚕数]×100%；当对照组死亡数<10%时，试验组死亡率=[（试验组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）]×100%。在Excel中计算出辛硫磷对蓖麻蚕的毒力回归方程和半致死浓度。

1.4蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因的克隆