贺安娜+伍贤进+李胜华+杨曦

摘要：以虎耳草的春叶和秋叶为材料，比较两者光合作用与有效成分含量差异，为虎耳草采收利用提供依据。结果表明：春叶和秋叶的净光合速率及蒸腾速率日变量均呈双峰曲线，上午10：00达最高，13：00出现“午休”，光合速率的降低受非气孔因子限制；春叶与秋叶光诱导的时间一致；高温对叶片净光合速率影响很大，秋叶在30℃以上净光合速率降低更明显；秋叶的F_v/F_m、F_v/F₀、q_P、Φ_PSⅡ和ETR值都比春叶的显著或极显著升高，q_N值显著降低。秋叶具有更强的光合能力，但秋叶岩白菜素和没食子酸含量极显著低于春叶。

关键词：虎耳草；叶龄；光合特性；有效成分

中图分类号：Q945.11 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0224—04

虎耳草为虎耳草科多年生草本植物，生于林缘、岩坡石隙，广泛分布于我国各地，全草人药，可消炎、解毒，民间常用于治疗中耳炎等病症。由于株叶优美，叶似虎耳，现多作为绿化植物栽培。虎耳草中岩白菜素含量很高，该类成分已被《中国药典》收录，具有止咳、抗炎的功效，近几年研究发现，虎耳草中所含的没食子酸有抑制前列腺癌的作用，有关虎耳草有效成分及药理药效的研究逐步增多。

光合作用是植物的重要生理活动，它对环境的变化很敏感，单一环境因子及多因子综合作用对光合作用的影响，以及逆境条件下光合作用的变化已有大量的研究报道，以往的研究也发现同种植物不同叶龄的光合速率存在较大差异。虎耳草属典型的阴生植物，经过炎热强光的夏季，植株发生了很大变化。作者所在课题组在之前的研究发现，虎耳草在春季光合速率最高，有效成分含量则在冬季最高，但相关性研究表明，虎耳草中岩白菜素和没食子酸含量在室温和强光下积累较多，光合速率与有效成分含量呈显著正相关。有研究表明，植物不同叶龄的有效成分含量存在较大差异，基于以往研究，初步判断造成这种差异的原因是虎耳草叶龄的差异。本研究通过对虎耳草春叶和秋叶的光合特性及有效成分含量进行比较，旨在了解虎耳草光合作用及有效成分积累的特点，为虎耳草的采收和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

岩白菜素对照品和没食子酸对照品（中国药品生物制品鉴定所），经检查纯度为98%以上。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。

供试材料虎耳草为怀化学院生物园内栽培种，2012年及2013年3月选长势良好的植株進行盆栽，每盆种植3株，共15盆。栽培用的塑料盆上口径为22 cm，底部直径15cm，高20cm。置于湖南怀化学院生物园阴棚内（前期试验证明覆盖1层遮阳网是最适光照），喷头常规洒水。分别于2012年、2013年4月和9月对新长出的叶片进行挂牌标记。

1.6.2色谱条件使用LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）进行测定，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C₁₈（150 mm×4.6 nm，5 μm）。流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（73：29）；流速：1.02 mL/min；检测波长272 nm；柱温25℃；进样量20 μL。

1.6.3标准曲线制备及回收率试验 准确称取岩白菜素标准品20 mg和没食子酸标准品20 mg，以甲醇溶解制成浓度为1.00 mg/mL的溶液，再使用移液枪将其浓度分别稀释为0.100 0、0.080 0、0.060 0、0.040 0、0.020 0 mg/mL，经0.22 μm针孔滤膜过滤，置于超声波洗净的离心管中。按色谱条件进样测定，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。回收率试验中精密称定已知含量的虎耳草约0.50 g，分别加入适量的岩白菜素和没食子酸对照品，按供试品的制备的步骤提取。

1.6.4虎耳草叶中岩白菜素及没食子酸含量的测定 取虎耳草叶片干样1.0 g，按“1.6.3”节的方法准备，进样量20 μL。按外标法以峰面积积分值计算岩白菜素和没食子酸的含量。

1.7数据分析

所测定结果取平均值和标准误，利用SPSS及Excel统计软件进行分析与绘图。春叶和秋叶的生理生态差异采用t测验进行比较分析。

2结果与分析

2.1虎耳草春叶与秋叶的气体交换日变量

自然条件下，供试材料的净光合速率和蒸腾速率呈双峰曲线（图1），上午10：00达最高，13：00出现“午休”，下午14：30稍有回升，但仍低于上午。一天当中，春叶的净光合速率和蒸腾速率均略低于秋叶，春叶和秋叶日平均值差异显著（表1），其中净光合速率值差异极显著。

气孔导度和胞间二氧化碳浓度则在上午08：30最高，随着时间的推移越来越低，在中午13：00—14：30降至最低点，午后又有所回升。春叶的气孔导度除了14：30外，都要低于秋叶。而一天中春叶的胞间二氧化碳浓度值除14：30外都略高于秋叶。秋叶的水分利用率、气孔导度日平均值都极显著高于春叶，春叶和秋叶胞间二氧化碳浓度差异不显著。

判断叶片光合速率降低的主要原因是气孔限制还是非气孔限制，一般只根据胞间二氧化碳浓度的变化方向便可作出正确判断，胞间二氧化碳浓度降低表明气孔导度降低是主要因素。10：00—13：00，虎耳草叶片气孔关闭，引起胞问二氧化碳浓度降低，从而导致净光合速率降低。但早上08：30，气孔导度和胞问二氧化碳浓度都最高，净光合速率和蒸腾速率并未达最高，下午14：30以后净光合速率和蒸腾速率越来越低，气孔导度和胞间二氧化碳浓度却有所升高，说明影响虎耳草叶片光合速率的不尽是气孔因子。

2.2春叶与秋叶光诱导时间的比较

植物光合作用对光的响应不是立即发生的，需要经过一个光诱导过程，不同的植物、同种植物不同的光处理，光合作用诱导期的长短差别很大。从图2可知，虎耳草春叶和秋叶净光合速率在5 min时差别不大，随着时间推移两者净光合速率逐步上升，至25 min后基本持平，两者光诱导所需的时间一致，秋叶净光合速率高于春叶。

2.5春叶和秋叶重要有效成分含量比较

虎耳草中没食子酸和岩白菜素的保留时间分别为5.15 min和7.99 min（图4），理论板数均不低于3 000。

岩白菜素和没食子酸的标准曲线结果见表3，两者的相关系数均达0.999以上，回收率也可达98%以上。

虎耳草中重要有效成分含量测定发现，虎耳草叶中岩白菜素含量高于没食子酸（表4），春叶的没食子酸和岩白菜素含量分别为1.52、4.82 mg/g，均极显著高于秋叶。

3讨论

植物因素如叶片气孔导度、气孔阻力等是植物长期适应多变的环境和土壤而形成的一类自身调节因素，主要通过环境因子和土壤水分状况而间接影响植物的光合生理变化。从本研究来看，虎耳草叶片的净光合速率和蒸腾速率呈双峰曲线，上午10：00达最高，13：00出现“午休”，10：00至13：00气孔导度也逐步降低，因此这段时间净光合速率主要受气孔因素影响；午后气孔导度有所回升，净光合速率却进一步下降，导致胞问二氧化碳浓度的缓慢升高，此时净光合速率受非气孔因子限制。通过光诱导曲线和温度响应曲线可发现，不同虎耳草叶龄光诱导所需的时间一致，说明不同叶龄对光的敏感程度是一致的；短时的低温对光合速率影响不大，此时光合速率有关的酶活性并没有受太多影响，这是虎耳草适应低温环境了一种表现；高温对光合速率有负面影响，其中新长出的秋叶受影响更明显。

药用植物有效成分含量在不同的季节存在较大差异。苏春花等研究发现，阔叶箬竹冬季总黄酮含量最高，可溶性糖以春季最多，这与次生代谢产物合成的途径不同有关。虎耳草光合速率与有效成分含量呈显著正相关，但本研究发现光合速率高的秋叶，岩白菜素等有效成分含量显著低于光合速率低的春叶，这应该与岩白菜素、没食子酸代谢途径有关，叶龄长有利于此类次生代谢产物的积累。虎耳草春叶有较厚的表皮细胞和叶肉细胞，秋叶栅海比则高，岩白菜素与没食子酸合成积累在叶片中的组织化学定位值得进一步研究。

虎耳草在春季和秋季均有旺盛生长期，夏季的高温和强光、冬季的低温可导致虎耳草半休眠。综合上述，种植虎耳草应抓紧春、秋两季的生长期，给予充足的肥水条件，采收则应在夏冬2季进行。