杨德翠

摘要：红斑病是牡丹上一种普遍发生的病害，但不同品种抗病性不同，合适的鉴定方法将为抗病品种的准确筛选提供保障。选用抗性品种鲁菏红和感病品种赵粉作为试验材料，对牡丹离体叶片接种和活体植株接种病原菌进行抗病性鉴定。同时，对患病牡丹丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量进行测定。结果发现：离体接种试验中，鲁菏红和赵粉在选用的3个菌液浓度下病情指数均有显著差异，与活体接种时得出的结论一致，这表明离体鉴定方法可行。此外，与对照相比，牡丹感染红斑病后体内MDA和H202含量均升高，其中感病品种赵粉含量均显著高于抗病鲁菏红，说明红斑病抗感品种生理上存在着差异。

关键词：牡丹；红斑病；离体鉴定；抗病性鑒定

中图分类号：S432.2 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0168—03

牡丹雍容华贵，深受我国人民的喜爱。不但具有极高的经济价值，也有较高的药用价值，而且牡丹籽含油量和营养价值极高，是一种理想的油料资源，近年来栽培面积不断扩大。然而，由于管理的粗放，其病害程度逐年加重。其中发生普遍和危害严重的病害有3种：红斑病、根腐病、根结线虫病。牡丹红斑病也称霉病、轮斑病，是由牡丹枝孢霉菌（Cladosporium paeoniae Pass.）引起的，是牡丹发生最为普遍的病害之一。红斑病是一种叶部病害，发病程度可因品种和地块的不同而不同。如在山东菏泽地区，有高达80%以上的牡丹园病害发生率在50%左右，且重病园发病率甚至在90%以上。受害植株光合速率降低、光合机构破坏、抗氧化酶活性发生变化。从外部表现看，受害牡丹生长势差、丹皮、苗木产量低，花色衰退，严重时甚至死亡，严重阻碍了牡丹产业化的发展。

但不同牡丹品种抗病性不同，为了合理利用牡丹的抗病资源，达到控制病害的目的，需要有效地鉴定出抗病性强的品种，而合适的抗性鉴定方法是筛选抗性品种的保障。本试验研究抗性品种鲁菏红与感病品种赵粉离体和活体的抗病性鉴定方法，旨在为牡丹红斑病的快速鉴定及抗病机制研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

2013年秋天从菏泽采购的2个牡丹品种鲁菏红与赵粉移栽上盆，花盆规格45 cm×32 cm，花盆埋于大田越冬。2014年3月中旬移入温室，温室温度20～30℃。常规浇水施肥管理，植株生长正常。

1.2试验材料培养的处理牡丹枝孢霉菌分离和培养

病原菌C.paeoniae Pass.来自青岛农业大学生理实验室从病叶上用组织分离法分离并鉴定的菌种。在PDA培养基上培养，25℃黑暗培养10 d，待菌落长满培养皿时，用无菌水冲洗培养皿，用超声波将病原孢子散开，分别配成浓度为5.0×10⁴、2.0×10⁵、5.0×10⁵、3.5×10⁶孢子/mL的菌液，分别进行离体叶片和活体植株的接种。

1.3抗病性鉴定的处理方法

离体叶片接种法：选取鲁菏红与赵粉的枝条顶部的第2张、第3张，叶片以0.1%HgCl₂灭菌8 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌滤纸将水分吸干。分3个处理，处理1菌液孢子浓度为5.0×104个/mL；处理2菌液孢子浓度为2.0×10⁵个/mL；处理3菌液孢子浓度为5.0×10⁵个/mL。处理时将菌液40μL滴至叶片表面，在铺有无菌湿滤纸的培养皿中保湿，每处理均为50张叶。以无菌水处理叶片作对照，喷雾保湿。观察离体发病情况，10 d后统计病情指数。

活体接种法：选取鲁菏红与赵粉长势一致的植株，用喷雾法将3.5×10⁶个孢子/mL菌液喷于叶子的正反面至滴水，对照用蒸馏水代替。参照吴玉柱等的方法，利用喷雾器喷雾保湿3 d，并保持温室空气湿度达80%～90%。分别于处理后的20 d统计2个品种的发病率。

1.2牡丹病害病级鉴定标准

1.2.1活体鉴定标准 对牡丹活体喷施处理20 d进行统计，病状分级标准见表1。

染病指数（%）=∑（各级病株数×各级别代表值）/（调查总株数×最大级别代值）。

1.2.2离体鉴定标准 将牡丹红斑病进行人工离体鉴定，按照5级分级方法，将病级记录。然后根据公式算出病情指数，本试验发病情况调查分为0、1、2、3、4、5级（表2）。

染病指数（%）=∑（各级病叶数×各级别代表值）/（调查总叶数×最大级别代值）。

1.2.3丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量的测定 取活体处理20 d的牡丹枝条顶部第2张、第3张叶片进行MDA和H₂O₂含量的测定，方法均参照文献[8]，重复3次。

数据使用Excel处理，用SAS 8.1数据处理软件进行显著性分析。

2结果与分析

2.1牡丹离体鉴定结果

离体叶片发病初期，叶正、反面出现绿色针头状小点，后变为水渍状圆点，发病时呈现出褐色病斑，严重时发病处变为黑色，病斑扩展迅速，相连成片，并伴有霉味。鲁菏红和赵粉的对照均没表现出发病症状，但2个品种在病原菌处理下均有不同程度的发病表现。在浓度为5×10⁴孢子/mL处理中，鲁菏红发病非常轻，而在2×10⁵、5×10⁵孢子/mL处理下症状明显。赵粉在3个浓度下均表现出明显的病害症状，在所有浓度下病害症状均比鲁菏红重（图1）。随着处理浓度的增大，鲁菏红和赵粉病情指数均升高，但赵粉病情指数高于鲁菏红，说明在离体处理的过程中，所使用的鉴定方法和选用的病原菌浓度是合适的（表3）。

2.2牡丹植株活体处理发病统计

对鲁菏红和赵粉植株进行病原菌液喷施，保湿3 d后，赵粉叶正、反面出现绿色针头状小点，5 d时有病斑，而鲁菏红10 d时偶有小斑出现。30 d左右时，可扩展成10～25 mm大小的病斑，呈紫红色，大多数病斑有明显的同心轮纹，近圆形，最后病斑枯焦连成片（表4）。

2.3牡丹枝孢霉菌侵染过程中MDA和H₂O₂含量变化

MDA是细胞膜脂过氧化的重要产物，MDA的产生又可引起酶的变性和膜的损伤，会导致膜结构破坏，使膜透性增大，其含量高低可反映植物的受害程度。鲁菏红和赵粉在枝霉菌侵染20 d后，2种牡丹染病后MDA含量均高于相应对照组，其中鲁菏红比对照MDA高50%、赵粉比对照高84.6%（图2），表明MDA含量的升高反映出受伤害的程度。牡丹植株受侵染后H₂O₂的含量变化规律与MDA相似（图3）。由此可以判断，病原菌侵染后，MDA和H₂O₂含量升高，对细胞膜造成过氧化作用，膜受伤害。

4讨论

牡丹不同品种对红斑病的抗性不同，为了充分利用牡丹自身的抗病性，就要充分筛选抗病性品种进行研究，发掘抗病资源。由于离体鉴定法具有快速、节省空间等优点，因此建立合适的离体鉴定方法对筛选抗性品种非常重要。

本研究选用对红斑病抗性较强的鲁菏红和抗性较弱的赵粉作为试验材料，通过离体叶片接种病原菌和活体植株喷施病原菌，调查病情指數的大小来反映抗病性强弱。本试验结果表明，在浓度为5×10⁴、2×10⁵、5×10⁵孢子/mL处理下2个品种表现出明显差异，与活体鉴定中得出的结论一致，这说明离体鉴定所选择的浓度范围是合适的，也说明离体鉴定方法的可行性。在其他一些物种中也有离体与活体鉴定结果一致的报道，如赵志祥对水稻抗瘟性离体鉴定结果与常规的活体鉴定结果高度一致，黄振涛等报道小麦品种在抗秆锈病的离体鉴定方法与活体鉴定结论一致。然而，宋维富等发现小麦秆锈病离体与活体鉴定在个别品种上不完全一致。

在受病原菌侵染后，抗感品种的生理生化大部分具有差异。余文英等在甘薯抗疮痂病的研究中发现，感病品种的MDA上升幅度远高于抗病品种。本研究中受枝孢霉菌侵染的牡丹叶片中无论是MDA还是H₂O₂的含量，赵粉均显著高于鲁菏红。在牡丹藏枝红受病原菌Cylindrocladium caller-dense侵染后也观察到MDA和H₂O₂的含量升高的现象。柯玉琴等在研究烟草青枯病的MDA和H₂O₂含量时结果相似。然而江彤等研究却表明，在接种病原菌后抗性强的烟草品种MDA含量明显高于感病品种，这也许与寄主和病原的不同以及取材时间的不同有关系。

本研究中创建了牡丹红斑病的离体叶片鉴定法，在便于控制环境的条件下方便地鉴定品种抗红斑病的强弱，而且感病后MDA含量的变化也可作为抗病性强弱的参考，因此本研究结果可为牡丹抗病性的鉴定和抗病品种的筛选提供参考。