赵美荣+李永春+刘辉+秦海强

摘要：以5个抗旱性不同的小麦品种为试验材料，分析了干旱胁迫下小麦扩展蛋白活性与其抗旱性之间的相关性，同时检测了6个不同的扩展蛋白基因在干旱胁迫下的表达情况。结果表明，扩展蛋白活性与小麦抗旱性之间的相关性达98.7%，且基因TaEXPA3的表达受干旱胁迫调节，与小麦抗旱性密切相关。

关键词：小麦；扩展蛋白；活性；基因表达；抗旱性

中图分类号：S512.01 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0108—03

作为细胞壁蛋白，扩展蛋白（expansins）是一种细胞壁松弛酶，调节细胞壁的伸展性，是调节“酸生长”的关键因子。序列分析表明，扩展蛋白有一个庞大的基因家族，主要可分为expansin A（EXPA）、expansin B（EXPB）、expansin-like A（EXLA）和expansin-like B（EXLB）4个亚家族，其中EXPA、EXPB亚型是植物中存在的主要扩展蛋白。不同家族成员行使不同的功能，包括种子的萌发、根毛的起始和延长、茎和叶的生长、果实成熟、器官脱落、气孔运动等，几乎参与调节植物生长发育的整个过程。

随着研究的不断深入，扩展蛋白的抗逆性功能被逐渐发掘，成为当前研究的热点之一。研究发现，扩展蛋白在植物抵御干旱逆境方面起着非常重要的作用。干旱条件下，水稻通过根尖细胞壁伸展维持根的继续生长，而这种细胞壁的伸展主要是由扩展蛋白引起的。Jones等研究发现，复苏植物C.plantagineum叶片细胞壁在干旱条件下扩展能力明显增强，其扩展蛋白的活性也相应地提高。徐筱等分析了不同翦股颖草坪草品种在干旱环境下AsEXP1基因的表达，发现AsEXP1的表达与草坪草品种的抗旱性呈显著正相关关系。

作为世界性粮食作物，小麦的生长和产量常常受到干旱逆境的影响，其扩展蛋白也越来越受到关注。目前研究已知，小麦扩展蛋白是一个多基因家族，在小麦生长和发育过程中起着重要的作用。已有研究表明，在水分胁迫下，小麦胚芽鞘扩展蛋白基因表达和细胞壁扩展活性增强，过量表达小麦扩展蛋白基因的烟草抗旱性提高。为进一步了解扩展蛋白与小麦抗旱性的关系，本研究分析了5个不同抗旱性的小麦品种扩展蛋白活性、基因表达特性与其抗旱性的相关性，以探讨扩展蛋白抵御干旱胁迫的能力。

1材料与方法

1.1材料与处理

1.1.1植物材料 本研究采用5種不同抗旱性的小麦（Triticum aestivum L.）品种，抗旱性强的小麦有昌乐5号、HF9703；中度抗旱的小麦有鲁麦21；干旱敏感型小麦有济南13、921842。取萌发期胚芽鞘、幼苗期叶片进行试验。

扩展蛋白活性检测材料为黄瓜（中农8号），取下胚轴用于试验。

1.1.2材料培养 小麦胚芽鞘的培养：小麦种子经消毒（0.1%HgCl₂浸泡5 min，流水冲洗6 h）和催芽处理后，挑选30粒均匀一致的小麦种子，放置在铺有双层滤纸的培养皿中暗培养24 h；然后加25%PEG-6 000（-1.13MPa）模拟干旱处理（对照为正常水培），24 h后测量胚芽鞘长度。

小麦幼苗培养：挑选均匀一致的小麦种子，经消毒后，放在被水润湿的滤纸上发芽24 h，然后将发芽的种子有序地放进盛有石英砂的塑料盆（高8 cm，直径10 cm）中，在温度为（25±1）℃、光/暗周期为14 h/lO h条件下进行沙培，每天浇灌Hoagland营养液。当培养至小麦3叶1心时进行干旱胁迫处理，用25%PEG-6000模拟干旱胁迫处理，以正常营养液作为对照（CK）。3 d后，剪取其叶片用于试验测定。

黄瓜下胚轴培养：黄瓜种子经浸种和催芽（27℃、1 d）后，栽入湿蛭石中，在27℃下暗培养5 d，剪取子叶下约3 cm长的下胚轴，用于试验测定。

1.1.3酶及生化试剂 RNA提取试剂盒、Taq酶、反转录试剂盒等均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.4 PCR引物 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列来源于文献[10]，具体引物序列如下：

1.2试验万法

1.2.1小麦叶片细胞壁扩展蛋白的提取扩展蛋白提取参照McQueen-Mason等的方法进行。随机采取100 g小麦幼苗叶片，经匀浆、提取、离心、沉淀、回溶等步骤，获得扩展蛋白粗提液，-80℃保存、备用。

1.2.2扩展蛋白活性测定采用体外重组法进行扩展蛋白活性测定。以-20℃下冰冻保存的黄瓜下胚轴为底物，检测热失活的下胚轴在扩展蛋白提取液中的伸展活性，以此来表示扩展蛋白活性。仪器采用植物组织伸展测定仪，参考高强的方法，自行组装。

1.2.3 RT-MR检测扩展蛋白基因的表达 利用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后进行反转录，得到cDNA。再按下列程序进行PCR反应：94℃1 min，55～65℃50 s（不同的引物退火温度不同），72℃1 min，30个循环。扩增所用引物见“1.1.4”节，所用内参为Tubulin，引物为Tubulinl、Tubulin2。在相同的条件下进行以上PCR扩增，扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，用Lab Assistant TM Gel 3000 Series凝胶成像分析仪检测条带亮度，对反转录产物进行RT-PCR半定量分析。

1.2.4统计分析 所有试验测定均为3次或3次以上重复，试验结果的表示形式均为3次或3次以上重复试验的“平均值±标准差”。采用DPS软件（浙江大学）进行统计分析。根据所测定的试验项目选用多因素或双因素进行方差分析。采用Duncans新复极差法进行多重比较。

2结果与分析

2.1小麦品种的抗旱性鉴定

研究表明，低水势下胚芽鞘的长度可以作为小麦抗旱性鉴定的一个生理指标，成为小麦抗旱性鉴定的一个快速有效的方法，干旱条件下胚芽鞘长的小麦品种抗旱性强。因此，本研究利用胚芽鞘法对5个小麦品种——抗旱性强的昌乐5号、HF9703，中等抗旱的鲁麦21以及不抗旱的济南13、921842的抗旱性进行鉴定。结果发现，5个小麦品种的胚芽鞘长度依次为昌乐5号>HF9703>鲁麦21>济南13>921842（表1），这与生产上公认的品种抗旱性相一致。

2.2干旱胁迫下不同抗旱性小麦品种扩展蛋白活性

扩展蛋白作为一种细胞壁蛋白，在细胞伸长生长方面起着重要的作用，其促进细胞壁伸展的能力常用来表示扩展蛋白活性大小。研究表明，在干旱胁迫下，扩展蛋白活性增强，有利于提高植物的抗旱性。扩展蛋白活性检测有2种不同的方法，一种是直接检测活体植物细胞壁的酸伸展性，来表示植物本身内源扩展蛋白活性；另一种是通过重组法检测提取的扩展蛋白活性。本研究采用重组法，利用黄瓜下胚轴为媒介，检测了抗旱性不同的小麦幼苗扩展蛋白活性。结果如图1所示，在正常水分条件下，抗旱性不同的小麦扩展蛋白活性不同，抗旱性强的昌乐5号、HF9703的扩展蛋白活性显著高于干旱敏感性的济南13、921842，昌乐5号扩展蛋白活性几乎是921842的1.5倍；中等抗旱的鲁麦21的扩展蛋白活性介于中间水平。在水分胁迫下，5个小麦品种扩展蛋白活性均明显增强，尤其是昌乐5号、HF9703，其活性分别增加了33.0%、30.5%。

为了进一步明確扩展蛋白活性与小麦抗旱性的相关性，本研究分析了两者之间的相关系数，结果发现，扩展蛋白活性与小麦胚芽鞘长度之间的相关系数达98.7%，其相关性极显著。这些结果表明，扩展蛋白活性与小麦对水分胁迫的响应密切相关，且与小麦的抗旱性有一定关系。

2.3不同抗旱性小麦扩展蛋白基因表达对干旱胁迫的响应

自扩展蛋白被发现以来，已有大量关于扩展蛋白基因表达及功能研究的报道，小麦扩展蛋白也备受关注。Lin等已经从小麦中克隆了18个扩展蛋白基因，包括9个EXPA、9个EXPB基因。本研究从其中选择了6个扩展蛋白基因，包括3个EXPA基因TaEXPA1、TaEXPA2、TaEXPA3，3个EXPB家族扩展蛋白基因TaEXPB1、TaEXPB7、TaEXPB9，通过RT-PCR分析，检测了这些扩展蛋白基因在小麦幼苗叶片中的表达情况以及对干旱胁迫的响应。结果发现，6个基因在小麦幼苗叶片中均有不同程度的表达，这与Lin等的结果一致，但表达特性不尽相同（图2）。在正常水分条件下，TaEX-PA1、TaEXPA2、TaEXPB1、TaEXPB7的表达在不同小麦品种中没有明显的差异；TaEXPA3的表达具有明显的品种效应，即在抗旱性强的品种昌乐5号、HF9703中表达量较高，而在干旱敏感性的济南13、921842中的表达较弱；而TaEXPB9的表达与小麦品种的抗旱性没有明显的规律性。在受到水分胁迫处理后，扩展蛋白基因的表达受到不同程度的影响，TaEXPA1、TaEXPB1的表达比正常水分条件下的增加，但在品种间没有差异；TaEXP42的表达在昌乐5号、HF9703中的表达高于正常水分条件，但在鲁麦21、济南13、921M2中的表达与对照相比没有明显的差别；TaEXPB7的表达与对照相比差异不明显，且无品种问差异；TaEXPB9的表达仍然没有明显的规律性；与品种抗旱性有一定关系的TaEXPA3的表达在干旱胁迫下明显增加，而且不同品种增加的程度不同，这与小麦抗旱性呈一定的正相关关系。结果表明，小麦中不同的扩展蛋白基因可能行使不同的功能，因此其表达特性也有所不同。但确实有些基因，如TaEXPA3的表达可能与小麦的抗旱性有一定关系。

3结论与讨论

扩展蛋白在植物生长过程中起着重要的调节作用，而且与植物抗旱性密切相关。因此，本研究以抗旱性不同的小麦品种为材料，研究其扩展蛋白活性、基因表达特性在不同品种问的差异以及干旱胁迫后的变化，分析了扩展蛋白与小麦抗旱性之间的关系。

不同抗旱性小麦品种扩展蛋白活性不同，具体表现为：昌乐5号>HF9703>鲁麦21>济南13>921842，与其抗旱性强弱相一致。而且在干旱胁迫条件下，扩展蛋白活性明显增强，增强程度也因品种抗旱性不同而不同，其活性与品种抗旱性之间的相关系数达98.7%。基因表达分析结果表明，小麦扩展蛋白基因是一个多基因家族，不同成员表达特性不同，可能行使不同的功能。基因TaEXPA3的表达在干旱胁迫下上调，且与品种抗旱性相关，表明干旱胁迫诱导的扩展蛋白活性的提高与扩展蛋白表达上调有关，这与先前报道的其他植物扩展蛋白相一致。玉米扩展蛋白在水分胁迫下根维持生长中起着重要作用，Sabirzhanova等分析发现，干旱条件下玉米叶片中扩展蛋白基因转录水平提高；翦股颖扩展蛋白基因AsEXP1在干旱条件下的表达与品种的抗旱性呈显著正相关。这些结果表明，干旱胁迫通过诱导扩展蛋白基因表达上调，提高扩展蛋白活性，这对于维持干旱条件下细胞的伸长生长、提高植物抗旱性是有利的。

总之，扩展蛋白作为一种细胞壁蛋白，它在植物抗逆性方面的作用越来越受到关注，其作用机理还有待于进一步研究。