段丽君　邓青云　李国元　汪殿蓓

摘要：以冬枣花药为试验材料，探讨冬枣花药离体培养中不同麦芽糖浓度、不同激素浓度及低温预处理和高温预处理对花药培养效果的影响，建立一套更适合冬枣花药培养技术体系。结果表明：花药膨大率与出愈率之间有明显的相关性；在MS+2，4-D1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麦芽糖20/L+琼脂4g/L培养基中最高花药愈伤组织诱导率达37.2%，4℃低温预处理3 d能显著提高愈伤组织诱导率，35℃高温预处理出愈率会显著降低。

关键词：冬枣；花药培养；愈伤组织；诱导；技术体系；膨大率；出愈率；影响因素

中图分类号：S665.104⁺.3 文献标志码：A

文章编号：1002—1302（2016）01—0060—03

冬枣（Ziziphusjujuba Mill.cv.Dongzao）为鼠李科枣属植物，别称果子枣、雁过红、庙上福、苹果枣、冰糖枣，果皮薄，核小，果肉汁多、细嫩酥脆、色泽鲜艳、甜味浓，富含钙、铁、锌等多种矿物质，维生素C含量颇丰富，素有维生素C之王的称号，其含糖量适中，味美可口，具有清理肠胃，有助于消化之功效，是美容和减肥的佳品。关于冬枣的花药培养研究较少，王娜通过诱导胚胎愈伤组织的途径对冬枣花药进行培养，获得1株单倍体植株；武晓红研究了甘露醇、不同温度条件预处理对枣花药愈伤组织诱导的影响；刘晓光研究了冬枣花药愈伤组织的诱导，悬浮系的建立、培养及愈伤悬浮系原生质体的分离。本试验分析了麦芽糖、激素和低温预处理等多种因素在冬枣花药愈伤组织诱导中的作用，建立一套更适合冬枣花药培养的技术体系，从而推动湖北省孝昌县冬枣产业的快速发展。

1材料与方法

1.1试验材料

冬枣花药采自湖北省孝昌县种植地。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织的诱导 5—6月选取直径为0.3～0.6 cm且花萼尚未张开的未成熟的新鲜花蕾，在70%乙醇中浸泡10 s，用无菌水冲洗3次，用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～4次，将花蕾转移至已经灭过菌、铺有滤纸的灭菌培养皿内，剥取花蕾，取出花药，接种到盛有50 mL固体培养基的100 mL的三角瓶中，每瓶接种30枚，每个处理接种10瓶，放在（26±1）℃培养室黑暗条件下培养，观察不同条件下花药愈伤组织的诱导。

1.2.2继代和分化培养 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时须要将这些组织转移到新的培养基上，继代培养基使用MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4g/L。每次继代培养约20 d，1～2次继代后，挑选脆的胚性愈伤组织转移至分化培养基MS+NAA 0.2 mg/L+麦芽糖20g/L+琼脂4 g/L上。

2结果与分析

2.1花药愈伤组织的诱导

花药在诱导培养基上培养2 d后，局部开始发生褐变，4～5 d后大部分的花药开始膨胀，出现不同程度的卷曲，花药在2周后逐渐开裂，3周后在花药花丝断裂处和药壁上长出愈伤组织或胚。从诱导的愈伤组织来看，大部分是淡黄色松散型（图1），这种愈伤组织经过多次继代培养，就更加松散，颗粒小，分散性很好，很难用镊子夹起来，而且胚性细胞多，可较长时期保持其分化能力，分化频率高。小部分是嫩绿色松散型（图2），一般都是从花药开裂处长出，分化频率较低。

2.1.1麦芽糖浓度对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将消毒后的花药分别接种在Ms培养基上，附加2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+琼脂4 g/L进行试验，由表1可以看出，冬枣花药膨大率和诱导率有显著影响。没有麦芽糖的培养基里，愈伤组织诱导率非常低，只有3.7%；愈伤诱导率随着麦芽糖浓度的提高而升高，当麦芽糖浓度达到20 g/L时，诱导率最高，为27.6%；当浓度达到30g/L时，会抑制愈伤组织的诱导。20 g/L麦芽糖产生的愈伤组织较好，呈黄绿色或黄色、块状、质地较硬、表面有颗粒状突起。有利于形成胚性愈伤，当麦芽糖浓度高于20 g/L时，绝大部分的愈伤组织容易发生褐化死亡。

2.1.2激素对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将消毒后的花药分别接种在Ms培养基上，附加麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L进行不同浓度的激素组合试验，由表2可以看出，花药膨大率与愈伤组织诱导率成正比关系，在培养基中添加不同浓度的生长素和细胞分裂素诱导频率不一样。单独使用1种细胞分裂素6-BA很难诱导出愈伤组织，只有同时添加生长素2，4-D和细胞分裂素6-BA才有利于花药愈伤组织的产生，在6-BA浓度一定的情况下，随着2，4-D浓度的升高，愈伤组织诱导率升高，而当浓度达到1.0 mg/L后呈下降趋势，且2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培养基的愈伤诱导率最高，达37.2%。

2.1.3低温预处理对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将冬枣的花蕾放人4℃冰箱中处理不同时间，将花药接种在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L培养基上进行培养，50 d后观察低温预处理对愈伤诱导率的影响，结果见表3。4℃低温预处理对花药的愈伤诱导有显著影响，预处理3 d愈伤诱导率达到46.6%，3 d后愈伤组织诱导率即显著降低，且一直持续降低，由诱导后0 d的37.2%最终降为诱导后7 d的9.8%。

2.1.4高温预处理对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将冬枣的花蕾放人35℃培养箱中处理不同时间，将花药接种在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L培养基上进行培养，50 d后观察高温预处理对愈伤组织诱导率的影响，结果见表4。高温预处理花药的愈伤诱导率显著降低，由诱导后0 d的37.2%最终降为诱导后7 d的3.7%。

2.2继代培养和分化培养

把直径为0.5 mm左右的愈伤组织放人继代培养基后（图3、图4）再转入分化培养基中，转接2 d后愈伤组织体积慢慢增大，1周后愈伤组织局部变为绿色（图5），2周后开始出现绿色的芽点，进一步分化成小幼苗。但大部分的愈伤组织多次分化后不能分化出小苗（图6），开始衰败，最后死亡（图7、图8）。

3结论与讨论

在花药培养中，糖是重要的碳源，主要功能是调节渗透压。王娜等认为，20 g/L麦芽糖对冬枣花药培养效果最好，愈伤诱导率高达57.81%。本试验结果表明，高浓度的麦芽糖有利于愈伤诱导，但随着麦芽糖浓度的增加，出愈率降低，愈伤组织生长量减少，这可能是增加培养中渗透压的表现；激素的种类和浓度对愈伤组织的诱导非常重要，对大多数植物来说，如果不在基本培養基中添加激素，就不能诱导愈伤组织。一般细胞分裂素促进细胞质的分裂，生长素促进核的分裂（促进DNA合成），在脱分化培养基中，两者共同使用对诱导愈伤组织十分重要，由于植物种类的不同，基因型决定其细胞分裂素与生长素的种类和浓度均有很大差异。在本试验中，2，4-D 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L为最佳的激素组合，愈伤诱导率最高达37.2%。在枣的花药培养过程中低温预处理对启动雄核发育发挥了重要的作用，有利于愈伤组织的诱导，这与武晓红研究枣花药培养中低温预处理影响的结论一致。