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藏山羊FGF21基因克隆及生物信息学分析

2017-05-17沈阅林亚秋梅寒李想张小玉

江苏农业科学 2016年1期
关键词:生物信息学分析克隆

沈阅 林亚秋 梅寒 李想 张小玉

摘要:为探讨藏山羊FGF21基因的分子结构特征,利用RT-PCR技术对该基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明:获得藏山羊FGF21基因序列650 bp,ORF长度为634 bp,编码209个氨基酸。氨基酸序列分析显示,藏山羊FGF21编码蛋白属于不稳定酸性蛋白,分子式为C1022H1596N276O296S5,分子质量为22.65 ku。预测该蛋白含有13个磷酸化位点,并与多种蛋白存在相互作用;无跨膜结构域,有信号肽结构。在47~164位氨基酸残基存在FGF结构域。亚细胞定位显示,FGF21蛋白大部分位于细胞质内。同源性分析指出山羊FGF21氨基酸序列保守性较高,与GenBank中藏羚羊、牛、印度水牛及猪等的同源性在90%-99%。本研究结果为阐明FGF21基因在藏山羊中的作用提供重要的基础数据。

关键词:藏山羊;FGF21基因;克隆;生物信息学分析

中图分类号:S827.2 文献标志码:A 文章编号:1002—1302(2016)01—0044—04

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是一类由FGF基因家族编码的结构相关的蛋白质。人类的FGF家族包括22个成员,按种系和序列又分为7个亚科,大部分FGF因子对细胞的生长和分化具有调节作用。成纤维细胞生长因子FGF21(fibroblast growth factor 21)是FGF家族的一个新成员,属于FGF家族中FGF19亚家族成员之一。FGF21主要在肝脏、脂肪和其他组织表达,它对机体的能量平衡调节和糖代谢具有重要作用,已经成为全球糖脂代谢研究的热点基因。

研究指出生酮饲喂小鼠可使小鼠体质量减轻,并且用生酮饲喂FGF21基因敲除大鼠,则老鼠出现体质量明显上升现象。Coskun等报道FGF21过表达的转基因鼠对多食诱导的肥胖有明显的改善作用,并可逆转肝脏脂肪变性及胰岛素抵抗,使体质量下降约20%。学者在给患糖尿病的恒河猴注射FGF21后发现其不仅对血糖有控制作用,还具有轻度的减重作用。研究发现肥胖患者空腹血清FGF21表达水平显著高于正常对照组,FGF21表达水平与腰围以及WHR、FPG、HbA1c、FINS、TG、hsCRP的表达水平呈显著正相关,与HDL-C呈显著负相关。上述研究结果都反映出,FGF21在脂肪代谢和控制体质量方面都起了非常重要的作用,但上述研究均集中在人和小鼠等动物及细胞系上进行,在动物脂肪沉积方面的研究尚不深入。在山羊上尚未见相关报道,仅见山羊FGF21的预测序列,因此需要进行更深入的研究。

藏山羊是我国青藏高原特有畜种,又称为“克什米尔”山羊,其肌肉细嫩、风味好,是藏族同胞重要的生产和生活资料。且藏山羊一般不需要专门肥育,是研究山羊优良肉质性状形成的理想材料。因此本研究以藏山羊为研究对象,应用RT—PCR技术获得FGF21基因序列,同时进行生物信息学分析,为进一步研究FGF21基因在藏山羊脂肪代谢及能量平衡中的作用机制,对提高藏山羊的育肥效率、提高肉品质提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物与组织的采集 以四川省若尔盖种羊场饲养的成年健康公藏山羊为试验动物,现场屠宰,迅速采集背最长肌组织样本,立即置于液氮中保存带回实验室备用。

1.1.2主要试剂 Trizol试剂盒、荧光定量试剂盒SYBR@Premix Ex TaqTM(2×)、pMD-19T Vector均购自大连TaKa-Ra公司,反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit均购于Thermo公司,Taq聚合酶、胶回收试剂盒与E.ColiDH5a感受态细胞均购于天根生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成按照Trizol试剂盒说明書提取藏山羊背最长肌的总RNA,测定D260nm与D280nm比值在1.8~2.0之间,检测RNA浓度和质量,然后取2μg按照反转录试剂盒说明书来合成cDNA第一链,-80℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成根据GenBank上山羊FGF21基因预测序列(XM_005692688),利用Primer Premier 5.0软件设计PCR克隆引物(正:5′-ACTGATGGGCTGGGACGA-3′;反:5′-TGCACAGCGGACGTCTTC-3′),产物长度为650 bp。引物送交四川成都擎科梓熙生物技术有限公司进行合成。

1.2.3藏山羊FGF21基因克隆 利用RT-PCR技术克隆臧山羊FGF21基因序列,PCR反应总体系为:2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL,模板cDNA 1μL,上、下游引物各1μL(10μmol/L),最后加水至25μL。扩增条件:94℃4 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃90 s,36个循环;72℃10 min。然后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,胶回收试剂盒纯化目的片段,然后再将产物与pMD-19T载体连接,并转化至感受态细胞中,经菌液PCR鉴定后送至四川成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.4藏山羊FGF21基因和蛋白的生物信息学分析 Prot-Param(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性质;ProtParam(http:∥Web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性质;NetPhos 2.0分析预测磷酸化位点;Signal P 4.1Server信号肽预测;TMHMM预测跨膜结构域;NPS预测二级结构,SWISS-MODEL三级结构预测;NCBI在线程序CDD预测保守功能域;通过PSORTⅡ进行亚细胞定位,利用STRING交互式数据库进行搜索蛋白相互作用分析;NCBI中Blast在线比对同源性分析,Clustalx 1.83和MEGA 5.0构建进化树;

2结果与分析

2.1山羊FGF21基因的克隆

用藏山羊背最长肌组织cDNA为模板经PCR扩增后获得FGF21目的片段,经琼脂糖凝胶电泳检测与预期相符(图1),测序后经Blast比对后确定其为藏山羊FGF21基因序列650 bp,分析表明FGF21基因序列起始密码子ATG位于5 bp处,终止密码子位于634 bp处,其中核苷酸序列的碱基组成分别为:A 17.2%,C 34.3%,G 29.8%,T 18.6%。

2.2藏山羊FGF21生物信息学分析

2.2.1蛋白理化性质分析 蛋白理化性质分析表明,藏山羊FGF21蛋白由209个氨基酸残基组成(图2),分子式为C1022H1596N276O296S5,分子质量为22.65 ku。带负电荷的氨基酸残基总数(Asp+Glu)为22个,带正电荷的氨基酸残基总数(Arg+Lys)为20个,即该蛋白质可能带负电荷。结合不稳定系数(52.g7)、理论等电点(6.08)和平均疏水指數(0.293)可知,FGF21蛋白为不稳定、酸性不溶类蛋白。且分析显示藏山羊FGF21的47~164位氨基酸序列残基存在FGF结构域(图2、图3)。

2.2.2蛋白磷酸化位点分析 经磷酸化位点预测,在76、79、122、152、195、200、204和206位共有8个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,在68和98位共有2个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,在132、201和207位共有3个络氨酸(Tyr)磷酸化位点。

2.2.3蛋白跨膜结构分析信号肽 分析结果指出山羊FGF21蛋白无跨膜螺旋结构。在1~28位氨基酸处存在信号肽。

2.2.4亚细胞定位及蛋白相互作用分析 通过PSORTⅡ预测,主要在细胞质(55.6%)和细胞核(22.2%)发挥生物学作用,少量作用于液泡(11.1%)和线粒体(11.1%)。利用STRING交互式数据库进行搜索FGF21蛋白相互作用,条件限制在10个蛋白以内。搜索结果表明,FGF21蛋白可能和FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARA、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4蛋白存在相互作用。构建蛋白相互作用网络(图4)。

2.2.5蛋白二级结构与三级结构预测 通过SOPMA在线软件预测藏山羊FGF21蛋白二级结构(图5),结果显示,在藏山羊FGF21的209个氨基酸中,33个(15.7%)氨基酸可能形成α-螺旋(h),48个(22.97%)氨基酸可能形成β-折叠占(e),19个(9.09%)氨基酸可能形成β-转角(t),109个(52.15%)氨基酸可能形成无规则卷曲(c)。通过I-TSSER软件预测山羊FGF21蛋白三级结构(图6),该三级结构与二级结构预测结果基本一致。

2.3藏山羊FGF21预测的氨基酸序列与其他物种同源性比较

通过NCBI中BlastN程序和BlastP程序分别进行同源性在线分析,结果表明,藏山羊FGF21推测的氨基酸序列与藏羚羊(XP_005955412)、牛(XP_005895443)、印度水牛(XP_006050969)、猪(NP_001156882)、马(XP_001489202)、人(NP_061986)、小鼠(NP_064397)、大鼠(NP_570108)、家犬(XP_541510)和野骆驼(XP_006173890)的同源性分别为99%、99%、99%、91%、86%、85%、75%、74%、90%和90%,表明藏山羊与藏羚羊的亲缘关系最近(图7)。

3讨论与结论

FGF21是近年来发现的一种与糖脂代谢关系密切的内源性脂肪细胞因子,有助于脂肪的代谢,是饥饿时抑制生长的重要因子。并且体外研究表明它可以降低血糖、抑制胰高血糖素的分泌、改善脂代谢。Varady等指出FGF21在猪的脂肪控制中具有调控作用,并且生长激素可以直接刺激牛肝脏中FGF21的表达。基于此,畜牧工作者对FGF21在动物脂代谢中的作用也非常关注。因此本试验通过克隆得到藏山羊FGF21基因序列,为后续在山羊中的研究奠定基础。

本试验通过RT-PCR技术克隆得到藏山羊FGF21基因序列650 bp,编码209个氨基酸,具有FGF家族典型的结构。推测的氨基酸序列与藏羚羊的同源性最近,这符合物种的进化规律。同时利用生物信息学分析了藏山羊的磷酸化位点、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级和三级结构以及蛋白相互作用等。结果发现,藏山羊FGF21没有跨膜结构,具有信号肽结构,含有13个磷酸化位点,并主要发生在丝氨酸残基上(8个),推测其翻译后修饰主要是通过此来进行的。二级结构预测发现在藏山羊FGF21氨基酸序列主要有33个α-螺旋、48个β-折叠、19个β-转角和109个无规则卷曲结构,并且三级结构预测也证明了二级结构的预测,有利于进一步阐明藏山羊FGF21的功能。

本研究发现经过蛋白质相互作用分析预测与藏山羊FGF21相互作用的蛋白可能是FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARα、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4等。

有研究指出FGF21的启动子上有PPARα结合位点,具有上调FGF21表达的功能,禁食和饲喂可以通过PPARα促进FGF21在肝脏中的大量表达,本试验的预测结果与之一致。但关于FGF21在藏山羊中的具体的作用机制需要试验来进一步证明。

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