李维　林家栋　刘若余　谢海强　李思　杜雪琴　肖超能

摘要：本试验以加利福尼亚兔和新西兰兔为研究对象，分别用磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒提取新西兰兔和加利福尼亚兔的DNA，通过构建DNA池，扩增UCP1基因的第5外显子及第4内含子部分序列。扩增产物进行双向测序，利用DNAStar和BLAST分析测序结果。结果发现：在加利福尼亚兔中没有发现SNP位点，在新西兰兔中有4个多态性位点，分别为G743T、A744G、C819A和G849T，其中G743T为同义突变，A744G为错义突变，导致编码的苏氨酸（Thr）变为丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突变位点位于内含子区。多态位点的出现对UCP1基因的RNA二级结构产生的影响表现在其最小自由能由-1.93 MJ/mol变为-1.932 MJ/mol，同时SNPs位点对UCP1基因蛋白结构也有一定影响。

关键词：UCPl基因；新西兰兔；加利福尼亚兔；SNPs；RNA二级结构

中图分类号：S829.12 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0041—03

解偶联蛋白（uneouplingprotein，UCPs）是褐色脂肪细胞线粒体内膜上存在的一种质子转运蛋白，它存在于动物的各组织中，在能量平衡、维持体温、机体产热和代谢等方面都起着巨大的作用。比如，它激活后可以产生质子电化学梯度降低，使呼吸链与ATP（三磷酸腺苷）合成过程解耦联，使能量以热的形式释放；UCP1基因参与机体能量代谢，对机体能量平衡涉及的食物转化效率、静止代谢率和体重肥胖等性状具有明显的效应，对肌肉生长和品质的改良作用重大。目前，这个家族的5种蛋白质在鱼、禽类、哺乳动物甚至在人类的不同组织线粒体的内膜上都已发现。其中，UCP1是最早发现的成员。

UCP1是褐色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）中表达的标记基因，它具有解离氧化磷酸化耦联功能，如机体通过在线粒体中产生能量，三羧酸循环产生的还原当量通过电子将能量释放，使H⁺从线粒体基质转移至内膜面，形成1个跨线粒体内膜的质子电化学梯度，当线粒体的ATP合酶将H⁺从内膜面顺梯度运回至基质面时，其能量可推动二磷酸腺苷与磷酸结合，促使生成ATP。UCP1基因的表达增加可能是受到去甲肾上腺素促进，使其与G偶联蛋白相关的环磷酸腺苷合成，后者又可使蛋白激酶激活，蛋白激酶作用的靶蛋白包括激素敏感性脂肪酶，这种酶一旦被磷酸化激活就可以抑制三酰甘油的贮存，使脂肪分解，非脂化脂肪酸增加，促进产热作用。此外，UCP1表达增加还有可能受肾上腺素和甲状腺素等的刺激，从而增加棕色脂肪组织所消耗脂肪酸的活性，因此UCPl被认为是2型糖尿病和抵抗肥胖的重要基因。

Clark等发现，UCP1基因的表达水平对羔羊出生后的成活率起着重大作用。Bassett等发现，UCP1基因的表达对初生羔羊BAT的含量影响重大。然而对兔线粒体中UCP1基因方面的研究很少，本试验以加利福尼亚兔和新西兰兔构建其DNA池，对UCP1基因第5外显子及第4内含子部分序列进行扩增，BLAST分析其测序结果筛选多态位点，由DNAStar软件进行序列拼接、校正，并预测其对RNA结构影响和等位基因频率估算。

1材料与方法

1.1样品的来源

从贵州贵阳白云牛场大林农牧专业合作社种兔场和贵州贵阳修文盛鑫兔业开发有限公司种兔场采取加利福尼亚兔的组织样48个和新西兰兔组织样48个，将采取的样品放在已编好序号的自封袋中于-20℃冰箱中保存。

1.2构建DNA池和引物设计、合成

利用磁珠法动物基因组（组织）DNA抽提试剂盒提取DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提的DNA，取5μL构建DNA池。以兔UCPl基因（其GenBank登录号为：NC_013683.1）DNA序列利用Primer-BLAST设计1对引物来扩增UCPl基因第5外显子和第4内含子的部分序列，将所设计的引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。物序列为F：GAGGTAAGTCCATCCCCACG，R：ACTCTTCTA-ACGATGTAGTGTC；退火温度为59℃；目的片段大小为809 bp。

1.3 DNA的扩增和序列的分析

反应体系为25μL：2×Taq PCR Master Mix试剂12.5μL，基因组DNA 2.5μL，三蒸水7μL，上、下游引物10 pmol/μL各1.5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用凝胶成像系统观察结果，最后拍照保存。

将扩增的产物送往立菲生物技术有限公司进行双向测序。用DNAStar软件校正测序结果，通过BLAST软件对SNPs进行确定。

1.4测量峰高及等位基因频率估算

利用MWSnap软件对SNP位点等位基因的相应峰高进行测量，可依据如下公式f_i=h_i/（h₁+h₂），i=1，2，对等位基因频率进行估算。f_i表示SNP位点某等位基因频率，h₁表示SNP等位基因1峰的高度，h₂表示SNP等位基因2峰的高度。

1.5 RNA二级结构预测和蛋白质二级结构预测

通过在线预测软件：http：∥rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi，对UCPl基因突变前后不同DNA序列进行RNA二级结构变化的预测，通过蛋白质二级结构在线预测软件：https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html，对UCPl基因突变前后不同蛋白氨基酸序列进行蛋白质二级結构预测。

2结果与分析

2.1 PCR产物扩增

设计1对引物分别扩增加利福尼亚兔和新西兰兔的UCPl基因第5外显子及第4内含子部分序列。PCR扩增（图1）后送往立菲生物技术有限公司进行双向测序，BLAST分析共发现4个SNPs（图2）。NCBI中SNP数据库尚无该基因SNP信息，本试验所筛查的SNPs均为新发现多态性位点，以UCP1基因第1外显子第1位为+1位，SNPs位点分别为G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T为同义突变，A744G为错义突变，导致编码的苏氨酸（Thr）变为丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突变位点位于内含子区。

2.2估算SNPs等位基因頻率

通过MWSnap软件对加利福尼亚兔和新西兰兔SNPs等位基因峰高进行测量，根据公式估算4个SNPs位点等位基因频率（表1）。由表1可知，内含子C819A和外显子A744G在加利福尼亚兔和新西兰兔中有较大差异，而外显子G743T和内含子G849T在2种兔品种中差异较小，且加利福尼亚兔的4个位点基因频率均高于新西兰兔。

2.3预测UCP1基因的RNA二级结构

预测突变前后UCP1基因的RNA二级结构，结果表明，SNPs导致RNA二级结构发生改变，并导致RNA二级结构最小自由能发生变化，由-1.934 MJ/mol变为-1.932 MJ/mol，这不仅可能影响RNA二级结构的稳定性，还可能影响后续蛋白质翻译过程（图3）。

2.4突变前后UCP1蛋白二级的预测

通过在线SOPMA服务器预测新西兰兔UCP1基因突变前后蛋白质二级结构变化，结果表明：突变前后α螺旋由109变到110，而B转角由39变成40，延伸链由86变到83，自由卷曲由72变到73（表2）。

3讨论

大量的研究表明，UCP基因家族与畜禽肉质关系密切。涂荣剑等对猪的UCP3基因研究发现，突变可能导致相应编码氨基酸序列的改变，从而影响胴体、肉质性状。韩瑞华等对牛的UCP3基因进行研究，发现UCP3基因不仅对肉牛胴体、肉质性状等方面具有重要影响，而且对肉牛的育种工作具有指导作用。王涛等研究了UCP基因对鸡肉质和猪肉质量的影响。肌内脂肪沉积是兔肉肉质标记辅助选择中重要的选择指标，筛选出对家兔肌内脂肪沉积有影响的基因有助于加快品种选育进程和提高家兔肉质性能。

目前对兔的UCP1基因多态性研究报道很少，本试验以加利福尼亚兔和新西兰兔为研究，对UCP1基因第5外显子及第4内含子部分序列进行扩增，将扩增的PCR产物进行双向测序，结果发现4个新的多态性位点：G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T为同义突变，A744G为错义突变，导致编码的苏氨酸（Thr）变为丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突变位点位于内含子区。比较加利福尼亚兔和新西兰兔多态性位点等位基因频率发现，内含子C819A和外显子A744G在加利福尼亚兔和新西兰兔中有较大差异，而外显子G743T和内含子G849T在2个兔品种中差异较小，且加利福尼亚兔的4个位点基因频率均高于新西兰兔。

突变前后UCP1编码蛋白二级结构也发生了改变，B转角由39变成40，α螺旋由109变到110，延伸链由86变到83，自由卷曲由72变到73。突变前后UCPl基因RNA二级结构发生改变，其最小自由能由-1.934 MJ/mol变为-1.932 MJ/mol。这说明该位点可能影响2个品种的肌内脂肪沉积等肉质性状差异，下一步工作将分析该多态性位点与兔肌内脂肪沉积性状的关联性，就UCP1基因对兔肉质性能的调控作进一步探究，从而为线粒体中相关基因对兔肌内脂肪沉积影响提供一定的依据。