郜卫华　田罗　黄廷华　姚敏　许巧情

摘要：利用RACE技术，克隆了凡纳滨对虾钙网蛋白（calreticulin，CRT）基因（GenBank登录号：JQ682618）。该基因（LvCRT）cDNA全长1866 bp，含有1个长达1 221 bp的完整开放阅读框（ORF），编码的成熟肽由406个氨基酸组成，5′UTR（5′非编码区）长度为222 bp，3′UTR长度为423 bp，3′端加尾信号AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp处。预测其理论分子量是15.3 ku，等电点pI为4.90。具有1个保守的钙网蛋白家族标签（KHEQNIDCGGGYLKVF），1个信号肽（MKTWVFLALFGVVLVES）和保守的HDEL内质网回收标签。经NCBI BLASTX比对表明，LvCRT基因与中国明对虾和斑节对虾的LvCRT具有高度的相似性和一致性。系统进化分析表明，LvCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白基因。荧光定量PCR结果显示CRT在肌肉组织中表达量最低，在肠中的表达量最高。对凡纳滨对虾CRT基因全长cDNA序列克隆和表达的研究为更进一步了解CRT多肽在凡纳滨对虾中的重要功能奠定了基础。

关键词：凡纳滨对虾；钙网蛋白；基因克隆；表达

中图分类号：S917.4 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0036—05

钙网蛋白（calreticulin，CRT）最初是由Ostwald等在兔肌肉细胞的糙面内质网中被发现的。近年来研究表明，CRT不仅存在于内质网腔中，在细胞表面和胞外基质中都有表达。Luan等研究表明，CRT在中国明对虾（Fenneropenae-us chinensis）肝胰腺、鳃、肌肉、肠、淋巴器官、血细胞和卵巢中均有表达，其中卵巢的表达量最高。成熟的钙网蛋白包括3个不同的功能結构域：N-功能域负责结构底物蛋白，P-功能域和C-功能域可以结合钙离子并使这种结合更加稳定。目前为止，已公布的甲壳动物的钙网蛋白序列包括中国明对虾Fenneropenaeus chinensis（DQ323054）、斑节对虾Penaeus monodon（HQ259085）和克氏原螯虾Pacifastacus leniusculus（HQ596362）。

作为内质网分子伴侣蛋白，钙网蛋白除了在细胞功能中扮演重要的作用，如内质网钙离子平衡和分子伴侣功能外，还参与了包括生长、繁殖、蜕皮、免疫功能、细胞凋亡和氧化及胁迫响应的多种生物学过程。本研究根据长期低盐诱导消减cDNA文库中差异表达基因的同源序列和RACE方法，克隆了凡纳滨对虾CRT（LvCRT）基因，并利用荧光定量PCR技术对其组织特异性表达进行了的分析，以期为凡纳滨对虾胁迫生理相关基因的克隆研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验动物

试验用虾购自广东海兴农生物科技有限公司，于广东海洋大学东海岛实验基地水泥池暂养1周，取健康凡纳滨对虾，经灭菌DEPC水清洗后，先将其冰浴麻醉，冰浴条件下分离血细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共5种组织，迅速装入1.5 mLeppendoff离心管（RNase free），并立即投入液氮速冻，后转移至-80℃冰箱保存备用。

1.2总RNA的提取

取凡纳滨对虾血细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共5种组织，按照联合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）的操作步骤，研磨、裂解组织后提取总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度计对提取的组织总RNA进行定性和定量检测。

1.3 LvCRT cDNA全长克隆

1.3.1 LvCRT cDNA片段的获得 根据构建的消减cDNA文库得到的LvCRT的EST序列（146 bp）和中国明对虾CRT保守序列，重新应用软件Primer Premier 5.0设计正反向引物（LvCRTF1/LvCRTR1）克隆中间片段，本试验中所有引物皆由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。PCR反应体系为20μL，反应条件为：95℃5 min；95℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，35个循环；72℃10 min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用PCR产物凝胶回收试剂盒（OMEGA，USA）回收扩增片段，回收后与Easy Digestion T-vector（pED-T）（Si-noBio，Shanghlai）载体连接，并转入感受态细胞DH5α中。挑取阳性克隆菌落送往深圳华大基因公司测序，将所得LvCRT基因cDNA中间序列于NCBI中进行BLASTX同源性分析。

1.3.2 LvCRT cDNA 3′端和5′端的获得 根据SMARTerTMRACE cDNA Ampllication Kit（Clontech，USA）和5′RACE Sys-tem for Rapid Amplification of cDNA ends（Invitrogen，USA）试剂盒操作步骤，分别扩增LvCRT基因cDNA的3′端和5′端序列，整个过程所需的引物序列见表1。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，接下来的DNA回收、连接转化、测序和同源性比对等步骤均同“1.3.1”节。

1.3.3序列分析 采用BioEdit软件将中间序列、3′端序列和5′端序列拼接得到LvCRT基因全长cDNA序列。设计正反向引物（LvCRTF/LvCRTR）对该基因进行ORF开放阅读框克隆以确保全长的正确性。此过程采用Ex Taq DNA聚合酶，PCR反应条件：95℃4min；95℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，35个循环；72℃10 min。冰箱4℃保存。接下来的DNA回收、测序和同源性比对等步骤均同“1.3.1”节，所用引物序列见表1。

1.3.4 LvCRT cDNA全长生物学信息分析 通过NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTX进行蛋白序列同源性检索；通过http：∥expasy.pku.edu.cn网站上的ExPASy软件对该cDNA全长进行序列开放阅读框搜索、蛋白质分子量、等电点和氨基酸序列的推断等；通过http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站上SignalP3.0软件预测该基因的信号肽；通过Clustal W1.8软件进行氨基酸多重序列分析，再结合MEGA 4.0软件用邻接法构建NJ系统树（Neighbour-Joining tree）。

1.3.5实时荧光定量PCR分析 根据已克隆LvCRT基因和口一actin内参基因，使用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量表达的特异性正反向引物LvCRTF′/LvCRTR′和β-actinF′/β-actinR′（表1）。使用Fermentas RevertAidr^TMFirst StrandcDNA Synthesis Kit（MBI，LTU）试剂盒合成cDNA第一链。具体如下：在冰浴后PCR管中加入1μg总RNA和1μL Oligo-dT（15）（0.5μg/μL），然后再加入DEPC水配制成10μL体系，将反应管置于PCR仪中，70℃预变性5 min，迅速置于冰上。变性反应结束后再加入4μL5×First—strand缓冲液、2.0μL0.1 mo]/L DTF、1.0 μL RiboLock^TMRibonuclease inhib-itor和2.0μL dNTP mix（10 mmol/L）后将PCR管置于PCR仪中，37℃孵育5 min，再加入1μL SuperscriptⅡ（200 U/μL），将PCR管置于PCR仪中进行反应，42℃孵育50 min，70℃变性10 min，4℃保存。实时荧光定量PCR使用SYBRμPremix Ex Taq^TM（TaKaRa，Japan）试剂盒在ABI 7500 Real Time Thermal Cycler荧光定量PCR仪（Applied Biosystem美国应用生物系统）中进行，定量数据分析采用相对定量中的2-AACt法（Hvak和Schmittgen，2001）；使用SPSS 13.0软件进行显著性分析；用Turkey法进行多重比较分析。

2结果与分析

2.1 LvCRT全长cDNA序列的克隆及分析

以凡纳滨对虾肝胰腺cDNA为模板，采用分段克隆方法和3′RACE、5′RACE法对CRT基因全长cDNA序列进行克隆，得到全部中间序列（397 bp）（图1）和3′末端（990 bp）、5′末端（742 bp）（图2），采用BioEdit软件去除重叠序列以及接头序列后得到1866 bp的cDNA全长序列，将获得的凡纳滨对虾LvCRT cDNA全长序列提交NCBI，GenBank登录号为JQ68261 8。经http：∥au.expasy.org/tools/dna.htmL在线软件分析显示，该基因具有1个长达1 221 bp完整的开放阅读框，1个起始密码子（ATG）和1个终止密码子（TAA），开放阅读框编码具有406个氨基酸的钙网蛋白。基因5′端非编码区（5′-UTR）长222 bp，3′端非编码区（3′-UTR）长423 bp。3′端的加尾信号AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp处。开放阅读框进一步验证结果表明cDNA全长序列的正确性（图2）。经http：∥web.expasy.org/compute_pi/在线分析，该蛋白分子量为15.3 ku，等电点pI为4.90。

2.2 LvCRT cDNA特征的分析

用http：∥/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网上SignalP3.0软件在线预测该基因信号肽，结果显示，该基因具有1个疏水信号肽（MKTWVFLALFGVVLVES），该信号肽位于氨基酸N端（图3）。使用在线http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos软件预测该基因蛋白磷酸化位点，预测结果显示该蛋白共有22个磷酸化位点，其中5个为Ser磷酸化位点，其氨基酸位点分别为27、76、83、124、191；11个为Thr磷酸化位点，其氨基酸位点分别为50、66、77、94、139、179、222、229、246、298、344；6个为Tyr磷酸化位点，其氨基酸位点分别为126、180、269、283、297和304（圖4）。

通过NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）蛋白质保守区的结果显示，推测LvCRT中第19～330个氨基酸残基构成了1个由311个氨基酸组成的保守区，该保守区属于钙网蛋白家族。该基因还具有1个保守的钙网蛋白家族标签（KHEQNIDCGGGYLKVF），该标签位于第95～111个氨基酸残基之间。除此之外，还发现该基因具有1个钙网蛋白家族的重复序列IxDxExxKPE（/D）DWD和1个保守的HDEL内质网回收标签，这个内质网回收标签位于氨基酸序列的c末端（图5）。

2.3 LvCRT基因序列比对与系统发育分析

使用ClustalW 1.83和MEGA 4.0软件，选取中国明对虾（ABC50166），斑节对虾（AD000927），克氏原螯虾（AEC₅₀079），意蜂Apis mellifera（XP_392689），冈比亚按蚊Anophelesgambiae（AAL68781），家蚕Bombyx mot/（BAC57964），黑腹果蝇Drosophila melanogaster（CAA45791），斑马鱼Danio rerio（Np_956007），小鼠Mus musculus（AAH03453），人Homo sapi-ens（NP_004334），拟南芥Arabidopsis thaliana（NP_176030），烟草Nicotiana tabacum（CAA59694），非洲爪蟾Xenopus laevis（CAA47866）13个物种的CRT氨基酸序列与凡纳滨对虾的CRT氨基酸序列进行比对。分析显示，凡纳滨对虾全序列与斑节对虾（ADQ28317）、中国明对虾（ABC50166）、克氏原螯虾（AEC50079）和黑腹果蝇（AAF54416）分别具有99%、99%、94%和81%的序列相似度，99%、97%、89%和69%的序列一致性（图6）。系统发育分析显示，构建的分子进化树可以将CRT基因聚类分为植物、脊椎动物和无脊椎动物3个分支，LvCRT位于无脊椎动物CRT的一支，与昆虫的CRT聚类在一起（图7）。

2.4 LvCRT基因在组织中的表达分布

荧光定量PCR分析结果显示，LvCRT基因在凡纳滨对虾所检测的组织包括肌肉、鳃、肠、肝胰腺和血细胞中均有表达（图8），由高到低依次为：肠道>鳃>血细胞>肝胰腺>肌肉，肠道中表达量最高，显著高于其他各组织；血细胞和肝胰腺问的LvCRT表达量无显著性差异，但二者均显著高于肌肉而低于鳃；肌肉表达量最低，显著低于其他各组织。

3讨论与结论

目前，钙网蛋白的研究多集中在模式生物上，甲壳动物中钙网蛋白的研究相当少。迄今为止，已公布的对虾类钙网蛋白序列仅包括中国明对虾（DQ323054）、斑节对虾（HQ259085）和克氏原螯虾。

本研究以先前建立的盐度胁迫诱导凡纳滨对虾消减cDNA文库为PCR模板，成功克隆到凡纳滨对虾的钙网蛋白LvCRT基因的cDNA全长序列，并对其进行了氨基酸的预测和同源序列的比对分析。LvCRT基因与斑节对虾（ADQ28317）、中国明对虾（ABC50166）和克氏原螯虾（AEC50079）具有99%、99%和94%的序列相似度，99%、97%和89%的序列一致性。LvCRT基因推导的氨基酸序列具有1个311个氨基酸组成的高度保守区和1个高度保守的钙网蛋白家族标签（KHEQNIDCGGGYLKVF），这与栾伟报道的中国明对虾FCCRT钙网蛋白分子结构极为相似，即与底物结合的相关的N-和P-2个功能域都非常保守，据此推测，LvCRT可能与之前报道的钙网蛋白具有相似的分子伴侣功能。系统发育分析显示，LvCRT位于无脊椎动物CRT的一支，在亲缘上接近于昆虫的CRT。

以往的研究表明，钙网蛋白作为重要的内质网分子伴侣蛋白，在病原感染、发育以及环境胁迫等情况下都对细胞起到重要的保护作用。钙网蛋白最初被鉴定为一种内质网的钙离子结合蛋白，之后其作为分子伴侣蛋白在内质网行使的众多功能得到一一阐明。近期的研究结果又证明钙网蛋白在免疫中扮演重要的作用，如吞噬、补体途径、细胞粘连甚至自體免疫等过程。Johnson等研究表明，若缺乏CRT，小鼠胚胎的死亡会增高、细胞黏附活性会降低、细胞对凋亡的敏感度增加、心肌的非正常发育会增加、非折叠蛋白的积累和错误折叠会增加等。在哺乳动物中，CRT在炎症反应和病原感染过程中起重要的作用。昆虫中的CRT不仅参与早期的包囊作用，且很可能参与了昆虫的免疫过程。Wang等在感染WSSV的中国明对虾中，利用基因芯片技术发现CRT基因在感染6 h和濒临死亡的对虾体内会显著上调表达。Duan等在感染鳗弧菌和WSSV的脊尾白虾中发现，血细胞和肝胰腺在感染第1个6 h后CRT转录水平表达量的上调表明其与免疫防御有关联。栾伟发现在热休克、重金属胁迫和感染WSSV的中国明对虾中，CRT转录表达会有明显变化，且不同重金属处理有不同的CRT转录表达模式。Visudtiphole等研究表明，斑节对虾仔虾血细胞的CRT基因在热休克胁迫3 h后会显著上调表达，可以作为斑节对虾对热应激的分子生物标记。结合本研究中盐度胁迫的消减文库中CRT基因的发现，表明LvCRT与环境胁迫之间存在一定关联，未来可以作为一种环境胁迫或者种质改良的分子标记。