李茹，程滨，赵瑞芬，滑小赞，王钊

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原030031）

不同剂量的核桃青皮对氮在土壤中转化的影响

李茹1，程滨2，赵瑞芬2，滑小赞2，王钊2

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原030031）

为研究核桃青皮对氮在土壤中转化的影响，明确其对土壤氮转化效应，采用室内培养试验方法，研究土壤中施入不同用量的核桃青皮时，土壤中硝态氮、脲酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的变化。结果表明，与对照相比，施入核桃青皮确实有一定的硝化抑制效应，且核桃青皮量是尿素2倍的比1倍的硝化抑制效应明显。综合考虑，在土壤中施用200%核桃青皮效果较好。

核桃青皮；硝化抑制；硝态氮；酶活性

氮是植物生长发育所需要的大量元素之一，也是对作物产量和品质形成起重要作用的元素[1]。我国是世界上化肥消耗量最大的国家，仅氮肥用量占世界氮肥用量的30.1%[2]，并出现进一步增加态势。现在多数国家土壤贫瘠，为了使农作物增产，会在土壤中施用大量的肥料，以增强土壤的肥力[3]。其中，常见的氮肥有尿素、硫酸铵等，其主要成分为铵态氮[4-5]。氮肥在施入土壤中后，被土壤中的酶分解，最终以氨挥发、硝态氮的淋失、氧化亚氮释放等进入自然环境，对水体和大气产生污染，甚至形成温室效应等环境问题[6-7]。

化肥大量施用已经造成地下水污染、温室气体排放增加等大量环境问题，提高化肥利用率，是实现化肥零增长的有效途径之一[8]。中国科学院南京土壤研究所对全国782个田间试验点的氮肥利用情况进行调查，结果表明，我国氮肥利用率为28%～ 41%，平均为33.7%，比发达国家低10%～15%[9]。大量研究表明，应用硝化抑制剂能显著提高氮肥利用率[10-12]。目前，化学合成的硝化抑制剂已经作为氮肥增效剂应用在肥料中。

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，核桃属，外部有一层厚厚的绿色果皮，即为核桃青皮。有研究表明，核桃叶、枝、青皮、树皮都有药用价值，因核桃青皮中含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、二芳基庚烷类、萜类、有机酸类等化合物，具有抑菌和消毒等功能[13-15]。朱天慧等[16]报道了核桃青皮可以抑制硝化作用，减少N2O的排放。此外，核桃青皮作为有机物质施入土壤，可以改善土壤环境、提高土壤有机质。

本试验比较系统地研究了核桃青皮对土壤中硝化抑制作用的影响效果，旨在探讨核桃青皮的施用剂量，以明确核桃青皮对氮是否有硝化作用，为获得一种天然的、价廉物美和无土壤污染的氮肥增效剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土壤为壤土，采自汾阳市0～20 cm耕层土壤，通过多点采样法进行采集，把采取的土壤样品进行风干，清理掉土壤样品中与试验没有关系的物质，在其经过混合、搅拌、磨细等过程之后，过2 mm筛，放置待用。供试土壤的基本理化性质列于表1。核桃青皮用量分别为：纯氮量的0%（CK），100%（处理1），200%（处理2）共3个水平，每处理4次重复。供试尿素用量为每千克风干土0.5 g。

表1 供试土壤的基本理化性质

1.2 试验设计

在备用的土壤样品中取200 g置于培养皿中，通过用喷水容器在土壤表面喷洒一定量的蒸馏水，对土壤样品的含水量进行调节，使其达到WHC（田间最大持水量）的60%，因为试验所采用的土壤样品是风干土，因此其水分含量按3%计算。在培养试验开始之前，将0.1 g尿素和不同用量的核桃青皮分别添加到玻璃培养皿中，充分混匀；后将培养皿放置在温度25℃的智能植物培养箱中进行培养[17]。在放入培养箱后，第1，3，5，7，11，15，20，25，30天分别对培养皿中的土壤进行取样，土样质量约为25 g。同时将2.0 mol/LKCl溶液倒入样品中，进行充分混合，浸出土壤样品溶液，然后过滤，将滤液保存在-20℃冷冻箱中，以抑制土壤中的无机氮转化为有机氮，以免影响样品中硝态氮的测定。在培养过程中，培养皿中的土壤水分会蒸发损失，因此，每隔2 d通过称重法用蒸馏水补充。培养结束后，对土壤样品进行风干，用于测定土壤酶的活性。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 硝态氮含量的测定[18]将2 mol/LKCl溶液加入土壤样品中，对土壤进行浸提（m（KCl）∶m（土）＝5∶1），用振荡器振荡30 min后，用流动分析仪对土壤中硝态氮含量进行测定。

1.3.2 土壤脲酶的测定其采用比色法[19]。在碱性溶液中及亚硝基铁氰化钠催化剂存在下，以尿素为基质产生的脲酶酶促产物与苯酚-次氯酸钠反应并且会生成蓝色的靛酚，578 nm比色测定酶促反应后蓝色靛酚的量，来表征脲酶的活性，酶活性单位为mgNH3-N/（24 h·gsoil），以mg/g计。

1.3.3 土壤硝酸还原酶的测定其采用比色法[20]。在培养皿中加入硝酸钾溶液，然后将抑制亚硝酸还原酶活性的2，4-二硝基苯酚添加进培养皿中，经过化学反应后会产生亚硝酸根离子，然后将它和Грисс试剂混合在一起，使其产生颜色反应，并在520 nm条件下进行比色，进行酶促反应，并且对反应过程中生成的亚硝态氮的含量进行测定，来比较土壤中所含有的硝酸还原酶的活性，酶活性单位为mgNO2-N/（24 h·gsoil），以mg/g计。

1.3.4 土壤亚硝酸还原酶测定[21]其采用比色法。在土壤中加入一定量的亚硝酸钠溶液，把亚硝酸钠作为反应的底物，在反应进行过程中，会产生一定量的亚硝酸根，将产生的亚硝酸根和盐酸萘乙二胺试剂进行显色反应，并在520 nm条件下进行比色，然后通过测定亚硝酸还原酶酶促反应前后亚硝态氮含量之差，来表征土壤中亚硝酸还原酶的活性，酶活性单位为mgNO2-N/（24 h·gsoil），以mg/g计。

1.4 数据统计

数据结果采用Excel 2007和SPASS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮对土壤中硝态氮转化的影响

2.2 核桃青皮对与尿素转化有关的土壤酶的影响

2.2.1 核桃青皮对土壤中脲酶活性的影响土壤脲酶在土壤氮素循环中有着不可替代的作用[22]，土壤中含氮有机物的转化也需要脲酶的参与，土壤氮素供应强度常常用其活性强度来表示。脲酶比较专性，由于土壤中脲酶的存在，土壤中的尿素才能够进行水解，变为氨、二氧化氮和水。在试验过程中，土壤脲酶的活性在初期和后期出现高峰（图2）。对土壤处理不一样，脲酶的活性出现高峰的时间也不一样，其中，对照出现的高峰时间是5，20 d；处理1出现高峰的时间是3，11 d；处理2出现高峰的时间是5，15 d。核桃青皮与对照相比，土壤脲酶活性并没有呈现明显的降低。表明核桃青皮能抑制土壤脲酶的活性，减缓尿素的水解，使得土壤可以较多地吸附尿素的水解产物，从而减少氨的挥发。

2.2.2 核桃青皮对土壤中硝酸还原酶活性的影响

硝酸还原酶作为一种催化剂，能使土壤中的硝酸盐在有氧条件下，转化为亚硝酸盐；在厌氧条件下，则起到反硝化作用[23-24]。本试验主要是为了验证硝酸还原酶的反硝化作用。通过分析得出，硝酸还原酶活性高峰出现的时间与脲酶完全不同，同时各个处理出现高峰的时间也不相同（图3）。

在试验过程中，不同处理的核桃青皮，在第7天左右出现了第1个活性高峰。与对照组相比，添加了核桃青皮的硝酸还原酶的活性均要高一些，而添加200%核桃青皮处理的硝酸还原酶的活性最高。在之后的培养过程中，由于添加的尿素会水解生成氨、二氧化氮和水，使得土壤中硝化作用提高，抑制了试验培养过程中土壤中硝酸还原酶的活性，这种变化与李东坡等[25]的研究结果大体上一致。土壤中的硝酸还原酶受核桃青皮添加量的影响，酶自始至终保持较高的活性，加快土壤中硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，降低了土壤中硝酸根离子的含量，同时也减少了土壤中硝酸盐不同程度的累积和淋溶，在反硝化作用进行的过程中，反应产生的NO3-作为底物会产生N2O等温室气体，硝酸还原酶会减少这种气体的产生，从而降低氮的损失和空气污染的可能性。

2.2.3 核桃青皮对土壤中亚硝酸还原酶活性的影响本试验主要研究的是亚硝酸还原酶作为土壤中的一种催化剂，在有氧条件下，使亚硝酸盐变为羟胺。土壤亚硝酸还原酶随着条件的不同呈现不同的变化趋势（图4），各处理时间随培养时间的延长，呈波动性下降趋势，而对照组波动性下降以后又有上升的趋势。

在试验过程中，添加核桃青皮的亚硝酸还原酶的活性均比对照高，而在培养开始后的第20天和第15天之后处理1和处理2分别低于了对照处理，说明核桃青皮随着时间的延长对土壤中亚硝酸盐还原酶的抑制作用下降。如果土壤中存在的亚硝酸还原酶活性比较高，那么在培养过程中就有可能加快土壤中累积的亚硝态氮转化为NH2OH的过程，从而减少其对土壤产生的伤害，降低亚硝酸盐氮的积累。

3 结论与讨论

在土壤中添加核桃青皮可以降低培养过程中NH3的表观浓度。添加核桃青皮既可以使得土壤中浓度保持在对照组之下，也可以在反应过程中使淋失的概率变小，大大地增强了土壤中的稳定性，使NH3的直接挥发量减少。在反应过程中，添加核桃青皮还可以促进黏附在土壤颗粒上，降低土壤中的含量，使尿素能够长时间保持肥效，提高氮素的综合利用率[26]。

本试验通过研究核桃青皮对氮在土壤中转化的影响，比较不同浓度的核桃青皮的抑制效果，并探讨了核桃青皮在酶学上的抑制机制，旨在选择土壤中较理想的核桃青皮量，为进一步提高氮素利用率、减少环境污染提供依据。结果表明，核桃青皮可使土壤中尿素水解的时间延长，使土壤中的氧化作用被抑制，降低土壤中的含量，并且延滞土壤中的硝化作用，降低淋溶及累积的可能性。核桃青皮使得释放密度大的时间变长，对反应过程中所进行的的硝化作用有着明显的抑制作用，大大提高了尿素的综合利用率。

在土壤中加入核桃青皮对与硝化作用有关的各种酶类都有不同程度的影响，如脲酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶等水解酶类，使土壤中的脲酶和亚硝酸还原酶不能发挥其最大的作用，而使土壤中硝酸还原酶的活性得到最大发挥，通过改变不同酶活性的方式，对土壤中的氮转化起到一定的作用。在土壤中加入200%核桃青皮效果较好。

［1］冯伟，朱艳，姚霞，等.小麦氮素积累动态的高光谱监测[J].中国农业科学，2008，41（7）：1937-1946.

［2］朱兆良.中国土壤氮素研究[J].土壤学报，2008，45（5）：779-783.

［3］李晓欣，张菲菲，马洪斌，等.华北平原地区农田硝态盐淋失研究进展[J].华北农学报，2011，26（Z2）：131-139.

［4］FAO.Fertilizer use bycrop[R].Rome:International Fertilizer Industry Association，International Fertilizer Development Center and Food and Agriculture Organization ofthe United Nations，1992.

［5］SANZ-COBENA A，SÁNCHEZ-MARTÍN L.Gaseous emissions of N2O and NO andleaching from urea applied with urease and nitrification inhibitors to a maize（Zea mays）crop[J].Agriculture， Ecosystems and Environment，2012，149：64-73.

［6］ZAMAN M，SAGGAR S，BLENNERHASSETT J D，et al.Effect of urease and nitrification inhibitors on N transformation,gaseous emissions of ammonia and nitrous oxide,pasture yield and N uptake in grazed pasture system[J].Soil Biology&Biochemistry，2009，41（6）：1270-1280.

［7］蒲玉琳，谢德体，林超文，等.紫色土区不同植物篱模式控制坡耕地氮素流失效应[J].农业工程学报，2014，30（23）：138-147.

［8］孙克刚，胡颖，和爱玲，等.控释尿素对小麦品种郑麦366产量及氮肥利用率的影响[J].河南农业科学，2009（8）：67-69.

［9］朱兆良.我国氮肥的使用现状、问题和对策[M]//李庆逵，朱兆良，于天仁.中国农业持续发展中的肥料问题.南京：江苏科学技术出版社，1998：38-51.

［10］陈振华，陈利军，武志杰.脲酶-硝化抑制剂对减缓尿素转化产物氧化及淋溶的作用[J].应用生态学报，2005，16（2）：238-242.

［11］CLOUGH TJ，DI H，CAMERONKC，et al.Accountingfor the utilization of a N2O mitigation tool in the IPCC inventory methodology for agricultural soils[J].Nutrient Cycling in Agroeco-systems，2007，78：1-14.

［12］MOIR J L，CAMERON K C，DI H J.Effects of the nitrification inhibitor dicyandiamide on soil mineral N,pasture yield，nutrient up take and pasture quality in a grazed pasture system[J].Soil Use and Management，2007，23：111-120.

［13］赵岩，刘淑萍，吕朝霞.核桃青皮的化学成分与综合利用[J].农产品加工，2008（11）：66-68.

［14］BUTTERY R G，LIGHT D M，NAM Y.Volatile components of green walnut husks[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2000，48（7）：2858-2861.

［15］姚焕英，唐静成，张鞍灵，等.核桃属植物化学成分及生物活性研究[J].西北植物学报，2003（9）：1650-1655.

［16］朱天慧.核桃青皮化感活性及作用机理研究Ⅱ[D].杨凌：西北农林科技大学，2009.

［17］曹建明，左秀锦，武志杰，等.几种吡唑类化合物的硝化抑制作用比较[J].中国土壤与肥料，2008（4）：53-56.

［18］鲍士旦.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，2000.

［19］关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1986：294-297.

［20］武志杰，隽英华，陈利军，等.一种检测土壤硝酸还原酶活性的分析方法：辽宁，CN101271060[P].2008-09-24.

［21］武志杰，孙志梅，张丽莉.一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法：辽宁，CN1979134[P].2007-06-13.

［22］李君.氮肥增效剂（NBPT/Nitrapyrin）对土壤氮素转化及滴灌麦田N2O排放的影响[D].石河子：石河子大学，2014.

［23］ABDELMAGID H M，TABATABAI MA.Nitrate reductase activity ofsoils[J].Soil Biol Biochem，1987，19：421-427.

［24］FU MH，TABATABAI MA.Nitrate reductase activity in soils：Effect oftrace element[J].Soil Biol Biochem，1989，21：943-946.

［25］李东坡，武志杰，陈利军，等.施用缓/控释尿素对玉米苗期土壤生物学活性的影响[J].应用生态学报，2006（6）：1055-1059.

［26］冯元琦.论新型氮肥：长效碳酸氢铵[J].化肥设计，2007，45（3）：59-62.

Effects of Different Doses of Walnut Green Husk on Transformation of Nitrogen in the Soil

LI Ru1，CHENGBin2，ZHAORuifen2，HUAXiaozan2，WANGZhao2
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofAgricultural Environment&Resources，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Tostudythe effect ofwalnut green husk on transformation ofnitrogen in the soil and clear its transformation effect on soil nitrogen，the paper uses indoor test methods,researches in the soil the different dosage of walnut green husk,the change of nitrate nitrogen in the soil,urease,and nitrate reductase and nitrite reductase.The results show that compared with controls,application the walnut peel does have a certain inhibitory effect,and the amount of walnut green husk is urea twice more than double the nitrification inhibition effect is obvious.Consideringthe effect ofapplying200%walnut green husk in the soil is better.

walnut green husk;nitrification inhibition;nitrate nitrogen;enzyme activity

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.30

S158

：A

：1002-2481（2017）05-0791-04

2016-12-09

山西省科技攻关项目（20150311014-4）；山西省农业科学院农业科技创新研究课题（ZDFYS1511）

李茹（1991-），女，山西永济人，在读硕士，研究方向：土地生产力恢复与荒漠化防治。程滨为通信作者。