刘建霞，温日宇，刘文英，梁彩霞

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同037009；2.山西省农业科学院玉米研究所，山西忻州034000）

EMS不同处理浓度和时间对红小豆诱变的影响

刘建霞1，温日宇2，刘文英1，梁彩霞1

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同037009；2.山西省农业科学院玉米研究所，山西忻州034000）

为了利用诱变育种技术快速地对红小豆种子进行遗传改良，在短时间内获得更多的优良变异类型，利用0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，1.0%，1.5%的EMS对红小豆种子进行处理，处理时间为5，10，15，20 h，以探讨不同浓度和时间EMS对红小豆种子发芽率的影响国；同时，还对其SOD，POD的活性变化进行了探索。结果表明，EMS诱变的最佳组合为浓度0.7%、处理时间20 h；EMS对种子及幼苗的SOD活性表现为明显增强，而POD的活性表现为低浓度促进、高浓度抑制。

甲基磺酸乙酯（EMS）；发芽率；红小豆

红小豆（Vigna angrlaris）属于豆科植物，也有人叫它赤小豆、亦豆、朱赤豆等，红小豆一般为细长形、椭圆形，长大约为5～6 mm，表面一般显示为暗棕红色，在其侧边有白色的种脐。红小豆营养价值极高，在全国范围内普遍栽种，分布广泛，是全民性的食品[1-3]。

红小豆的主要化学成分有三萜皂甙、膳食纤维、多种脂肪酸、糖类、甾醇、部分微量元素，还含有多种无机盐成分等。作为一种膳食纤维，其具有润肠通便，调节人体血糖、血脂的功效，还具有预防胆结石、帮助减肥等功效；含有皂角苷，能除恶毒、消肿痛；红小豆中富含叶酸，对乳汁不通的孕妇有催乳的作用；此外，还能够刺激肠道，利小便。所以，多吃红小豆对于健脾养胃、补血养血、清热解毒有很好的疗效。红小豆目前的研究，主要涉及遗传多样性、分类学等基础性的生物学方面[4-5]。红小豆育种研究始终举足轻重，其中无论是传统的还是现代的育种技术都起到了极其重要的作用。

使用EMS作为诱变剂进行诱变，因其操作简单，效果稳定，不易产生回复突变，突变类型广，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，且对染色体损伤小，是植物诱变育种中使用效果相对比较好的一种诱变剂[6-10]。EMS诱变育种研究中一个重要环节是诱变亲本材料及部位的选择，一般选择便于操作并且对诱变较敏感的器官作为诱变处理的部位[11-13]。种子是最早也是最常被用来作为EMS诱变处理的材料。

本试验以甲基磺酸乙酯（EMS）为诱变剂，研究不同处理浓度和时间对红小豆种子发芽率和发芽势的影响，以期为红小豆育种提供可靠的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本试验所选用的红小豆种子由山西省农业科学院高寒区作物研究所提供；甲基磺酸乙酯（EMS）购自上海潜度生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS诱变处理方法从试验材料中选取颗粒饱满的红小豆种子6 400颗；先用沸水烫种30 s，倒掉沸水，加入清水浸种15 h（温度22℃）；将浸好的种子平均分配到128个培养皿中，分别用0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，1.0%，1.5%的EMS处理5，10，15，20 h；诱变剂用0.1 mol/L的磷酸缓冲液作为溶剂溶解。为了去除种子上残留的EMS溶液，需要用流水对其冲洗，2 h即可；然后将处理好的种子转至事先准备好的培养基中（铺有双层滤纸），置于恒温培养箱中培养，温度设定为23℃左右，定期观察并统计发芽的种子数，调查7 d的发芽率；同时以不添加诱变剂的为对照组（CK），设置2个重复以保证试验结果的可靠性。

1.2.2 酶液提取取0.5 g的叶片于预冷的研钵中，加6 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH＝7.8）进行充分地研磨，形成匀浆状；然后加入缓冲液进行定容，定容至10 mL即可；然后以4 000 r/min离心20 min，上清液即为需要的酶的粗提取液。

1.2.3 SOD活性测定取10 mL试管4支，其中，2支为对照管，均加入0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH＝7.8）3 mL，130 mmol/L的Met溶液0.6 mL，750 μmol/L NBT溶液0.6 mL，100 μmol/L EDTA溶液0.6 mL，20 μmol/L核黄素0.6 mL，蒸馏水1.0 mL，酶液0.2 mL（对照组以失活酶代替），总体积为6.6 mL，将一支对照管放于黑暗处，其余各管均放在4 000 lx光照下反应20 min。

1.2.4 POD活性测定取10 mL试管4支，其中，1支为对照管，其余各管为试验管，各管均加入反应混合液3 mL，对照管加失活酶液1 mL，试验管加粗酶提取液1 mL；然后在470 nm下测定其OD值，用秒表计时，每隔20 s记录一次，连续读3次。

2 结果与分析

2.1 EMS对红小豆发芽率、相对发芽率的影响

从表1可以看出，随着EMS浓度的增大、处理时间的延长，红小豆的发芽均呈现出下降的趋势，与已有研究结果一致[6-8]。当EMS浓度达到1.5%、处理时间为20 h时，红小豆的发芽率由对照组的74%降到8%，说明红小豆对EMS是比较敏感的；随着EMS浓度和时间的增加，红小豆的相对发芽率呈现逐渐降低的趋势，当EMS浓度为0.7%、时间为20 h时，红小豆的相对发芽率为51.35%，接近半致死量，由此得出，EMS的最佳诱变组合为0.7%，20 h。

表1 不同浓度和时间的EMS对红小豆发芽的影响

2.2 EMS处理对红小豆幼苗POD，SOD活性的影响

POD（过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）以及CAT（过氧化氢酶）等是植物逆境生物学研究的主要对象，它们之间的协同作用可防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。POD是植物体内普遍存在且活性较高的一种酶，与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等生理代谢过程密切相关，在植物生长发育过程中，活性不断发生变化，POD的活性可反映这一时期植物体内代谢的变化[14]。

从图1可以看出，随着EMS浓度的增加，红小豆叶片POD活性呈现为先增加后降低的趋势，当EMS浓度为0.7%时POD活性达到最大，而当浓度超过0.7%时，酶活性逐渐下降。说明在EMS诱变浓度和时间适度时，POD的抗氧化活性增强。

SOD是一种含金属酶，普遍存在于需氧生物体内，参与氧的代谢，可以催化超氧阴离子发生歧化反应形成过氧化氢，过氧化氢又可以被CAT转化成无害的氧和水或者被POD利用[14]。由图2可知，红小豆幼苗SOD活性随着EMS浓度的增加，整体上呈现上升的趋势。说明红小豆幼苗可以利用自身的防护机制来适应EMS胁迫下的有害环境，EMS作用的浓度和时间未达到SOD活性下降乃至于逐渐失活的水平。

3 结论与讨论

3.1 EMS对红小豆种子发芽的最适诱变浓度和时间

已有大量研究表明，EMS作为诱变剂对种子发芽情况具有一定的影响。姜莉等[15]研究了EMS对甜菜种子诱变致死率的影响，结果确定10 h，2.5%和12 h，2.3%的EMS处理是比较好的诱变组合。慎家辉等[11]研究了甲基磺酸乙酯对杜梨种子诱变导致突变的鉴定与分析，结果筛选出最适宜的EMS处理浓度为0.4%，变异率为37.3%。张凯[14]用不同浓度和时间的EMS处理头花蓼，结果得出，EMS诱变头花蓼种子的最适诱变浓度和时间为0.6%，24 h和0.8%，12 h，经过处理的头花蓼播种成苗后存在广泛变异，诱变后植株生长加快、花青素含量降低。云娜等[16]用EMS对蒙红豆草进行诱变，结果得出，EMS处理对蒙红豆草荚果出苗进程具有延迟和抑制作用。曲高平等[17]用EMS对甘蓝油菜种子进行处理，结果得出，随着EMS浓度的增大，发芽率降低，发芽时间延长。由上述研究可知，EMS对不同种类的种子敏感度不同，处理后的效果可能为促进、抑制或者不影响。

本试验结果表明，叠氮化钠对红小豆最佳诱变组合为1.0 mmol/L，3 h；EMS对红小豆发芽的影响为抑制，且随着EMS浓度的增加，其发芽率、相对发芽率均降低，最佳诱变组合为0.7%，20 h；EMS处理时SOD活性会明显提高，而高浓度的EMS处理时POD活性表现为抑制、低浓度时表现为促进，且在EMS浓度为0.7%时酶活性达到了最大值。卢银等[18]用EMS处理大白菜种子，结果表明，对主要生化指标POD和SOD的活性检测具有协同效应，即低浓度表现为酶活性提高，高浓度酶活性抑制；而本试验中，EMS的处理时间和处理浓度可能还没有达到抑制SOD活性的水平，一直表现为高活性，是由于生物个体的差异还是其他方面的原因仍有待进一步研究。

3.2 影响种子发芽率因素的探究[19-22]

在试验时要对种子进行热烫，本试验是热烫30 s，然后再用自来水浸泡15 h，但对于最适合的热烫时间和浸泡时间及浸泡温度仍待进一步探究。

本研究试验时，红小豆会发生霉变，原因可能是由于红小豆种子本来就带菌，未对红小豆进行消毒处理，在培养过程中发生霉变，导致发芽率降低，影响试验结果的准确性。另一方面，在浸泡和培养过程中用的是自来水，自来水中也含有微生物，从而导致霉变。除此之外，随着培养时间的延长，种皮被破坏，也会加速种子的霉变。

在本试验过程中，选用20 mL的EMS溶液诱变种子，红小豆种子稍过大，可能未完全浸泡，诱变不充分。在配制EMS溶液时，使用的是0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH＝7），磷酸缓冲液要现用现配，以免失效。

本试验红小豆在25℃培养箱中培养，但对于最佳的培养温度仍待进一步研究。配反应混合液加H2O2时，要等到溶液冷却后才可加入，否则会引起分解，影响试验结果的准确性。

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Effect of Different Concentrations and Time EMS on Mutagenesis of Adzuki Bean

LIUJianxia1，WENRiyu2，LIUWenying1，LIANGCaixia1
（1.College ofLife Science，DatongUniversityin Shanxi，Datong 037009，China；2.Institute ofMaize，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Xinzhou 034000，China）

Tomake use ofthe mutation breedingfor genetic improvement ofadzuki bean seeds fast,and get more excellent variation types in a short time,these adzuki bean be treated in different time（5,10,15,20 h）and concentration（0.0%,0.3%,0.5%,0.7%,1.0%, 1.5%）of EMS to explore the effect on germination rate of adzuki bean seed sprout,and the suitable EMS dosage.In addition,the SOD, POD activity changes were studied.The results showed that the best combination of EMS mutagenesis was EMS concentration of 0.7%, tratment time of20 h,and EMSon seed and seedlingofSODactivitysignificantlyincreased,the activityofPOD showed lowconcentration promoted and high concentration inhibited.

EMS;germination rat;red bean

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.10

S521

：A

：1002-2481（2017）05-0715-04

2016-10-28

山西省科技攻关项目（20140311005-3）

刘建霞（1977-），女，山西朔州人，讲师，主要从事食用豆种质资源的创新与利用研究工作。