王强，潘丽红，吕丹，朱慧芬

1武汉科技大学医学院病原生物与免疫学系，武汉 4300652杭州医学院病原生物与免疫学教研室，杭州 3100003华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒载体构建及鉴定*

王 强1， 潘丽红2△， 吕 丹1，朱慧芬3

1武汉科技大学医学院病原生物与免疫学系，武汉 4300652杭州医学院病原生物与免疫学教研室，杭州 3100003华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

目的 构建共沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒，为进一步以Birc5和Hspa5作为肿瘤生物治疗靶点研究提供基础。方法 使用Ambion Target Finder设计Birc5和Hspa5 mRNA的干扰序列；挑取酶切鉴定正确的质粒转化菌液Birc5-siRNA和Hspa5-siRNA测序鉴定；采用分子克隆技术构建特异性沉默Birc5和Hspa5的双干扰siRNA质粒，命名为pgsiRNA-Birc5+Hspa5，酶切鉴定；将pgsiRNA-Birc5+Hspa5转染HepG2细胞48 h后采用Real-time PCR检测Birc5和Hspa5的mRNA表达水平。结果 经酶切鉴定正确的质粒转化菌液Birc5-siRNA和Hspa5-siRNA测序结果显示均为插入正确的克隆质粒；经酶切鉴定分析显示pgsiRNA-Birc5+Hspa5符合酶切鉴定结果；转染pgsiRNA-Birc5+Hspa5 48 h后HepG2细胞Birc5和Hspa5 mRNA表达均显著下降，未转染组Birc5和Hspa5 mRNA的相对表达量均为1.0，pgsiRNA-Birc5+Hspa5组Birc5为0.15(P<0.05)，Hspa5为0.37(P<0.05)，表明双干扰载体构建成功。结论 成功构建了Birc5和Hspa5双干扰siRNA质粒，为进一步同时靶向沉默肿瘤Birc5和Hspa5基因研究提供了工具和基础。

Birc5； Hspa5； siRNA

肿瘤的发生发展是一个非常复杂的过程，涉及多因素的参与，其病因及发生机制尚不完全清楚。研究证明Birc5选择性高表达于多种肿瘤，与肿瘤的级别增高、高复发率和患者的低存活率相关联，而在正常组织低表达[1-2]。沉默其表达可作为诱导肿瘤细胞凋亡的策略，然而通过单一沉默Birc5的表达诱导肿瘤细胞凋亡并未取得满意的效果。肿瘤微环境存在不利因素时，肿瘤细胞高表达Hspa5以对抗凋亡，并促进肿瘤的耐药、复发及转移[3-4]。……