梁德贤　李庆军　陈康荣

[摘要]目的：分析糖尿病心肌PTEN蛋白表达变化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。方法：选取健康成年SD大鼠，腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）（60mg/kg）诱导糖尿病模型。对照组给予等量的生理盐水。将糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠随机分为3组：假手术组（Sham）；缺血/再灌注组（IR）；缺血后处理組（IP0）。部分亚组糖尿病大鼠在缺血前1h用trFEN抑制剂BPV（HOpic）干预后再进行缺血/再灌注损伤实验。免疫组化方法分析心肌PTEN、PI-3K、p-Akt的表达；TYC法检测心肌梗死面积；TUNEL法检测心肌细胞凋亡。比较非糖尿病与糖尿病组及BPV干预前后糖尿病各组相应指标的变化。结果：IPo明显降低了非糖尿病鼠心肌细胞中PTEN的表达，增加了H-3K和p-Akt的表达，但未能减少PTEN在糖尿病鼠心肌中的表达，相应的Pl-3K和p-Akt的表达也无明显改变。与N+S组相比，N+IR及N+IPo组的凋亡指数增高（P<0.05）。但是经后处理干预后N+IPo组的凋亡指数低于N+IR组（P<0.05）。与DM+S组相比，DM+IR及DM+IPo组的凋亡指数增高（P<0.05），但后处理并没有减少糖尿病心肌的凋亡指数。与N+IR相比，N+IPo的梗死面积减少（P<0.05）。然而，DM+IR组与DM+IPo组的梗死面积无统计学差异（P>0.06）。BPV干预各组的心肌PI-3K及P-Akt的表达高于未干预各组（P<0.05）。与未经BPV干预的各组相比，被干预各组的心肌凋亡细胞减少。心肌梗死面积比较BPV干预的各组心肌梗死减少。结论：高血糖导致心肌PTEN高表达使PI-3K/Akt信号通路失活，是导致IPo对心肌IRI保护作用丧失的一个重要原因。

[关键词]糖尿病；缺血再灌注损伤；缺血后处理；PTEN；BPV

有研究发现PTEN（Phosohatase and tensin honologdeleted on chromosometen，PTEN）是PI-3K/Akt信号通路的负性调控因子。它起初被发现是一种肿瘤抑制基因。后来越来越多的研究发现它在调节细胞增殖、生长和凋亡中也起到重要作用。有研究显示，与非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠体内PTEN的表达明显增多，并会随着病程的延长增加其表达的程度。增加PTEN的活性会使胰岛素的敏感性下降，并且会增加2型糖尿病的风险。Mensah等人实验证明，通过阿托伐他汀进行IPC，可通过激活PT-3K/Akt信号通路，对非糖尿病大鼠心肌IRI产生保护作用，但对糖尿病大鼠心肌IRI的疗效显著降低，其主要原因是由于PTEN的拮抗作用。Crackower等人通过对mN半量表达的PTEN+/-小鼠离体心脏的研究表明，在P1EN+/-的小鼠体内，Akt的活性明显增加，经4周期的预处理PTEN+/-组的心肌梗死面积明显小于6周期预处理的PTEN+/+对照组。因此可以看出P1EN在糖尿病心肌IRI中也扮演着重要的角色。然而关于PTEN在缺血后处理（Ischemic postconditioning，IPo）的作用机制中发挥着怎样的作用，以及IPo对糖尿病心肌IRI保护作用的消失是否与糖尿病心肌中PTEN高表达有关，现在还不十分清楚。因此，本研究拟探讨糖尿病心肌PTEN蛋白表达变化及其在糖尿病心肌IPo中的作用。对比IPo对糖尿病和非糖尿病心肌PTEN/PI-3K/Akt信号通路的影响情况，及其对心肌IRI的改善情况；观察抑制PTEN的表达是否能改善糖尿病心肌的损伤程度；证明糖尿病心肌PTEN的高表达是导致心肌IRI耐受力降低和IPo保护作用消失的重要原因。

1.材料与方法

1.1材料 实验动物：220～280g成年SD大鼠130只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。主要试剂及仪器：SureStep血糖仪、血糖试纸（美国强生公司）；Bene View T5型监护仪（西安巨田医疗设备有限公司）；DW-2000型动物呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司）；高精度电子天平（精度0.0001g，上海越平科学仪器有限公司）；SHHW21Gr600恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；Olympus显微镜（日本Olympus公司）；Olympus BXS0显微摄影系统（日本Olympus公司）；EPSON-V30扫描仪（日本Epson公司）；ImageProPlus6.0计算机图像分析软件（美国Media Cyberneties）；链脲佐菌素（Streptozoein，STZ），美国Sigma公司；戊巴比妥钠（Pentobarbital），美国Sigma公司；伊文氏蓝（Evans blue），美国Sigma公司；三苯基氯化四氮唑（TTC），美国Sigma公司；Bpv（HOpic），瑞士Alexis公司；PTEN单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；P13K（P85cL亚型）单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；P-Akt（ser-473）单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化试剂盒，武汉博士德生物制品有限公司；TUNEL试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2方法 糖尿病大鼠及非糖尿病大鼠模型的建立：220～280g成年SD大鼠130只，喂养一周后，随机分为糖尿病组（n=90）和非糖尿病组（n=40），所有大鼠禁食12小时。腹腔注射1%STZ60mg/kg诱导糖尿病模型，非糖尿病组的大鼠腹腔注射等量的生理盐水，其余操作同糖尿病组大鼠。72h后禁食4h，断尾取血测空腹血糖。当血糖浓度≥16.7mmol/L，并且出现多饮、多食、多尿的症状表示糖尿病鼠模型诱导成功。模型成功后监测大鼠血糖和体重，每2周一次。所有大鼠普食喂养8周。8周后进行手术。淘汰标准：①血糖浓度<16.7mmol/L的大鼠，②饲养过程中死亡的大鼠。

实验分组：造模成功的糖尿病和非糖尿病大鼠随机分为9组，实验过程中剔除造模未成功和手术过程中死亡的模型，具体实验分组如下：非糖尿病+假手术组（N+s组）：n=9；糖尿病+假手术组（DM+S组）：n=9；非糖尿病+缺血再灌注组（N+IR组）：n=15；糖尿病+缺血再灌注组（DM+IR组）：n=15；非糖尿病+缺血后处理组（N+IPo组）：n=15；糖尿病+缺血后处理组（DM+IPo组）：n=15；糖尿病+假手术组+抑制剂组（B+DM+S组）：n=9；糖尿病+缺血再灌注+抑制剂组（B+DM+IR组）：n=15；糖尿病+缺血后处理+抑制剂组（B+DM+IPo组）：n=15。以上标有“*”的各组中6个心脏标本用于TFC，另外9个和非“*”的各组标本全部用于组织包埋。