唐莹+朱军+邓莹+代礼+李明蓉+宋庆高+熊贵发

[摘要] 目的 探讨TGFβ3和ARNT2基因与非综合征性唇腭裂发生的关系。 方法 收集了2006～2010年的119个中国南方非综合征性唇腭裂核心家系作为研究对象，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测TGFβ3基因的多态位点rs2300607和rs2268625，以及ARNT2基因的多态位点rs2228099和rs3768017，并进行传递不平衡检验（TDT）和基于核心家系的关联分析（FBAT）。 结果 TDT分析结果显示：TGFβ3基因中的rs2268625位点在唇裂合并腭裂核心家系中，存在传递不平衡（P = 0.02）。FBAT分析结果显示：ARNT2基因中rs2228099/rs3768017构成的CT和GG基因型与子代唇腭裂发生危险性增加有显著关联（P = 0.008、0.012）。 结论 在我国南方人群中，TGFβ3基因和ARNT2基因多态性与非综合征性唇腭裂存在关联。

[关键词] 唇裂；腭裂；TGFβ3；ARNT2；多态性；单核苷酸

[中图分类号] R788 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（c）-0115-05

Study on association between genetic polymorphism of TGFβ3， ARNT2 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in south Chinese population

TANG Ying1 ZHU Jun2 DENG Ying2 DAI Li2 LI Mingrong2 SONG Qinggao3 XIONG Guifa4

1.Department of Pediatrics， Chengdu Angel Maternity Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610042， China； 2.Center for Birth Defects Monitoring of China， Sichuan Province， Chengdu 610043， China； 3.Department of Oral Surgery， Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College， Guizhou Province， Zunyi 563003， China； 4.Department of Oral Surgery， Stomatological Hospital of Guiyang City， Guizhou Province， Guiyang 550006， China

[Abstract] Objective To study association between TGFβ3， ARNT2 polymorphisms and nonsyndromic cleft lip with or without palate. Methods 119 triads with NSCLP affected child from 2006 to 2010 were recruited in the study. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms （PCR-RFLP） was used to identify rs2300607， rs2268625 genotypes of TGFβ3 and rs2228099， rs3768017 genotypes of ARNT2. The data was analyzed by case-control analysis， transmission disequilibrium test （TDT） and family-based association study （FBAT）. Results In the TDT， T allele of TGFβ3 rs2268625 was preferentially transmitted to CLP patients （P = 0.02）. In the family-based association test， when a haplotype consisting rs2228099 and rs3768017 in ARNT2 was considered， the significant association between CT or GG haplotype and CL/P was observed （P = 0.008， 0.012）. Conclusion The genetic polymorphism of TGFβ3 and ARNT2 is relevant with nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the south Chinese population.

[Key words] Cleft lip； Cleft palate； Transforming growth factor β3； Arylhydro carbon receptor nuclear translocator 2； Polymorphisms； Single nucleotide

非綜合征性唇腭裂是口面部最常见的严重出生缺陷之一，在中国人群中其发生率为1.0‰～1.3‰[1]，在我国近几年出生缺陷的发生顺位中占第二或第三位，属高发畸形。非综合征性唇腭裂包括唇裂（CLO）、唇裂合并腭裂（CLP）和单纯性腭裂（CPO）[2]。人们认为CLO和CLP在遗传学上具有相同的发病机制，通常将两者归为一类，统称为唇裂伴或不伴腭裂（CL/P），而CPO的发生则可能是与另外一些基因相关。近年来的研究表明，唇腭裂因不同人种、地区、性别以及有无阳性家族史其发病率是不同的，25%～35%的CL/P和10%～20%的CPO患者都有阳性家族史[3-4]，遗传因素在CL/P和CPO的发病中占20%～50%[5]。研究认为，非综合征性唇腭裂是一种多基因易感性疾病，其发生受多个中效或轻度微效基因的相互作用，属于数量性状遗传[6-7]。本研究选取亚洲和欧美人群中争议较多的转化生长因子β3（TGFβ3）和尚未在中国人群中研究过的差异表达基因芳香烃核转位因子2（ARNT2）基因作为研究对象，分析其与中国人唇腭裂发病的关系，为进一步探讨非综合征性唇腭裂的发病机制奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

样本来自2006～2010年在遵义医学院附属口腔医院和贵阳市口腔医院就诊的唇腭裂患者的核心家系（患者和双亲），排除其他系统畸形如范伍德综合征、歌舞伎面谱综合征、腭心面综合征和Meckel综合征等，临床确诊为非综合征性唇腭裂，本研究方案通过华西第二医院伦理学委员会审核批准，严格遵守伦理学准则《赫尔辛基宣言》中人体医学研究的伦理原则，尊重每位采集对象的基因隐私权及自我决定权，女性均排除妊娠及哺乳，并获得每位采集对象的书面知情同意后才纳入本研究。共募集到119个核心家系，共359名，有2个唇裂家庭各有2名患儿，其余家庭都只有1名患儿。这些家庭分属于汉、彝、苗、侗不同民族。表1是对这些家庭基本情况的描述。

1.2 基因组DNA提取

抽取患儿及其父母外周静脉血5 mL，ACD抗凝，常规酚-氯仿法提取DNA。紫外分光光度仪定量后，取少量稀释备用。

1.3 PCR扩增与RFLP分型

在美国生物技术信息中心（NCBI GenBank）上查询TGFβ3基因rs2300607（T/A）和rs2268625（T/C）两个SNP位点，以及ARNT2基因rs2228099（G/C）和rs3768017（T/G）两个位点的上下游序列（网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。扩增引物由invitrogen公司合成，rs2300607的引物序列：5′-CTGGACAACATAGGGAGGAC-3′；5′-GCAATCTCGGCTCACTGTAG-3′，退火温度60℃，产物长度292bp，限制性内切酶用XapⅠ。rs2268625的引物序列：5′-GAGGGGTT- GTTGAGGAAGTC-3′；5′-AGGGAATCGTTGGCAGTA-TC-3′，退火温度64℃，产物长度245bp，用内切酶Hin 6Ⅰ酶切。

rs2228099的引物序列：5′-TTAGGGTGGAAACCTGTGGCTGTGGA-3′；5′-TGGTTCAAAACAGGAGTCACGGAGTCTGA-3′，退火温度64℃，产物长度264bp，内切酶用DdeⅠ。rs3768017的引物序列：5′-AGAAATAAAATCCAGGTCCCCAG-3′；5′-TCCTAAGAGTTCCTAGAATACAGAAAGCAG-3′，退火温度62.8℃，产物长度408bp，内切酶用SatⅠ。PCR总反应体系为25 μL，其中包括双蒸水15.3 μL，DNA凝胶加样缓冲液（10×buffer）2.5 μL，2 mmol/L的dNTPs 2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 1.5 μL，基因组DNA 10～800 ng（约1 μL），10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U。产物PCR扩增完毕后琼脂糖凝胶电泳检测结果。酶切体系为：PCR产物10 μL，10×缓冲液2 μL，酶4 U，加ddH2O至20 μL后放37℃水浴箱中过夜。次日将酶切产物于3%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙啶染色，照相保存结果。

1.4 统计学方法

计算各组等位基因和基因型频率，应用SPSS 10.0软件计算是否符合Hardy-Weinberg平衡检验；采用Curtis编制的ETDT2.5应用软件（http：//www.smd.qmul.ac.uk/statgen/dcurtis/software.html）進行传递失衡（TDT）检验。统计时将患病同胞拆分为独立样本家系；采用以家庭为基础的关联检验（FBAT）模型，应用统计软件fbat 1.41，在不同的遗传模型下，以子代，父母基因型作为基因型数据，以子代是否受累作为表型数据，对SNP位点与非综合征性唇腭裂表型之间是否存在关联进行线性回归模型检验。

2 结果

2.1 各位点的基因型分析

TGFβ3基因rs2300607的多态性表现为纯合子TT（140、107、45 bp），纯合子AA（247、45 bp），杂合子TA（245、140、107、45 bp）。rs2268625的多态性表现为纯合子TT（245 bp），纯合子CC（65、180 bp），杂合子TC（245、180、65 bp）；ARNT2基因rs2228099的多态性表现为纯合子GG（264 bp），纯合子CC（236、29 bp），杂合子GC（264、236、29 bp）。rs3768017的多态性表现为纯合子TT（408 bp），纯合子GG（379、29 bp），杂合子TG（408bp、329、29 bp）。

2.2 Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验

对于汉族CLO和CLP核心家系，患儿和父母各基因型的观察值与期望值间吻合度良好，分布未偏离H-W平衡（P > 0.05）（表2）；而对于汉族CPO核心家系，有三个位点的基因型不符合H-W平衡，不能进行后面的分析。其他少数民族家系数较少，且民族众多，分层后统计差异无统计学意义（故以下统计数据均来自汉族家系）。

表2 汉族唇裂、唇腭裂和单纯腭裂家系中两基因各SNP位点的

H-W平衡检验

2.3 传递不平衡检验（TDT）

进行基因分型的核心家系有119个，由于TDT要求运用杂合子父母及其患病子女做分析，故需排除纯合子父母家系，余下有效家系106个用于统计分析。结果显示TGFβ3的rs2268625等位基因与唇腭裂的发生有显著关联（P = 0.02），ARNT2的rs2228099等位基因与单纯腭裂的发生有显著关联（P = 0.04）。（TDT检验只针对符合H-W平衡的SNP位点进行，具体数据见表3～4）。

2.4 各SNP位点的FBAT分析结果

在FBAT加性遗传模式下，这四个SNP位点的单点分析结果与上面的TDT分析结果非常接近（表5）。在用FBAT分析TGFβ3基因与ARNT2基因的单体型数据时，将汉族CLO和CLP家系合并统计以获得更多的信息家系数，由于FBAT程序中默认设置最小的信息家系数为10，信息家系数低于10的主题（等位基因、基因型和单体型）将不被分析。结果显示TGFβ3基因2个SNP位点构建的4个单体型中，TT单体型的频率最高（0.529），TC单体型的频率最低（0.047），但对该单体型的分析获得一个有意义的结果（P = 0.045）（表6）；ARNT2基因2个SNP位点构建的4个单体型中，CT单体型和GG单体型都与CL/P的发生存在显著关联（P = 0.008、0.012）（表7）。

3 讨论

先天性唇腭裂发生在胚胎发育6～12周时，在致畸因素的作用下，面突、腭突的外胚间质细胞生长减慢或停止，上皮细胞与间充质细胞之间的相互作用受到干扰，腭中嵴上皮细胞不能正常增生、分化、凋零、退变，而是分化为口腔样的复层鳞状上皮，面突与腭突就只能部分融合或不能融合，出现不同程度的唇腭裂[8]。这个过程受到体内多种细胞因子及信息分子的调节，TGFβ族作为一类多肽生长因子也参与其中，动物实验表明，在胚腭突接触前，TGFβ3诱导腭胚中嵴上皮细胞膜外出现丝状伪足，丝状伪足表面有硫酸软骨蛋白多糖，介导腭突黏着。在腭融合时TGFβ3可能作为凋亡的誘导因子调节腭中嵴上皮细胞的转归，还可诱导腭成纤维细胞中基质金属蛋白酶-13的高度表达，而基质金属蛋白酶降解细胞外基质是腭融合中的关键步骤[9-10]。ARNT2是近年来被发现与唇腭裂的发生相关的侯选基因，它位于人类15q23-q25染色体，Abbott等[11]证实在C57BL/6N小鼠早期腭发育的不同时期中，ARNT mRNA有不同程度的上调表达。Barrow等[12]、Muraoka等[13]对AXB和BXA近交系小鼠进行基因组扫描，证实小鼠7号染色体上的ARNT2等位基因是CPO致畸易感位点，ARNT2基因敲除小鼠会产生包括CPO在内的畸形。Tami等[14]发现，TGFβ3或其信号通路中的其他因子与ARNT2基因编码蛋白所在的芳香烃受体通路有关，在暴露于某些环境因素时，两者之间有相互补充影响的作用。

关于TGFβ3基因与唇腭裂发生关系的研究最早在高加索人群中进行，如Lidral等[15]分析美洲高加索CL/P和CPO患者人群中的TGFβ3基因，发现第5外显子区X5.1与CL/P之间存在传递不平衡，X5.1-5′UTR单体型与CL/P之间也存在显著的传递不平衡。Maestri等[16]分析了160个家系受累患者唇腭裂的类型、人种、家族史与TGFβ3基因标记之间的关系，也发现TGFβ3与CL/P患者和CPO患者呈显著性相关。但Moreno等[17]和Beaty等[18]分析TGFβ3基因上的短串联重复序列，却未发现TGFβ3基因与唇腭裂发生存在关联或连锁。上述研究都是用微卫星遗传标记筛查法来寻找易感基因，使用SNP这类新型遗传标记寻找某基因与唇腭裂发生关系的研究较少。

我国人群中，研究TGFβ3基因与非综合征性唇腭裂关系的实验进行最多。众多的实验结论或相同或相悖，但设计方法多采用的是病例对照法，这种设计很难保证病例组和对照组来自遗传背景完全相同的人群，可能会因为人群分层（病例和对照在遗传背景上的差异）而导致虚假的关联结果。而病例父母对照研究则可避免这种差异，因为其本身就是患儿与正常父母之间的对照，可以得到更为真实的结果。FBAT检验是利用双亲基因型，受累子女基因型及其表型的家系数据，进行双等位基因或多等位基因与疾病表型的关联分析，它是由传递不平衡检验（TDT）扩展到对任何表型，多基因或环境因素的研究。其主要优势在于能有力地克服人群混合、人群分层以及性状的不同选择等混杂因素对分析结果的影响，允许在一个家系中存在多个受累对象，并能在不同的遗传模式下进行相关性检验分析等。本文就用这两种方法分析我国南方人群中TGFβ3和ARNT2基因与非综合征性唇腭裂的关系。

本文中TDT和FBAT单点分析结果都提示，TGFβ3基因的rs2268625位点与CLP的发生存在显著关联（P = 0.02），从亲代到子代该位点T等位基因传递更多；但该位点与CLO的发生没有关系。在对TGFβ3的单体型分析中，虽然TC单体型可能会增加汉族人CL/P发生的风险（P = 0.047），但该单体型的频率低于0.05，需要扩大样本量来增加说服力，再做进一步的解释。这与Eisaburo等[19]对112个日本CL/P核心家系的研究结果略有不同，他们发现TGFβ3基因的rs2300607（A>T）在日本人中存在显著传递不平衡（P = 0.041），rs2300607与rs2268625组成的单体型在TDT检验中得到的P值更低（P = 0.025），在日本人群中，这两个SNP位点构成的单体型比单个SNP位点与CL/P的关联性更强。造成这种现象的原因需要进一步探讨，目前认为，可能与人群中基因频率的不同有关，该位点等位基因A在日本CL/P患者[20]中的频率是0.37，而在中国人群CL/P患者中的频率则是0.42。

ARNT2的SNP位点rs2228099与CLO的发生有显著关联（P = 0.04），rs3768017有增加CLP发生的趋势，但未达到显著性水平（P = 0.07），我们发现，在FBAT检验中rs2228099与rs3768017构建的CT单体型和GG单体型比单个SNP位点得到的P值更低（P = 0.008、0.012），与CL/P发生存在更强的关联性。这些结果说明ARNT2是中国汉族人发生CL/P的易感基因，而ARNT2上与CL/P的发生关联性更强的SNP位点，应该位于与rs2228099/rs3768017单体型相连锁的区域。

本次实验发现，TGFβ3基因与我国南方汉族人群中非综合征性唇裂合并腭裂的发生有一定的相关性，但它是否是CL/P和CPO发生的主要易感基因仍有待研究。非综合征性唇腭裂是一种多基因疾病，可能还有其他在我国人群唇腭裂发生中起主导或辅助作用的致病基因。我们的后续实验将继续讨论其他相关基因与唇腭裂发生的关系，为探讨唇腭裂的发病机制奠定基础。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編辑：李亚聪）