穆仪冰+张桂英

[摘要] 目的 采用激光捕获显微切割技术（LCM）结合iTRAQ标记定量蛋白质组技术，筛查结肠癌间质的差异表达蛋白质。 方法 ①选择12对结肠腺癌标本为观察组，其配对正常结肠黏膜（与结肠癌标本至少相距10 cm以上）为对照组，采用LCM技术分别纯化其间质作为生物样本；② iTRAQ标记定量蛋白质组技术鉴定两组间的差异表达蛋白质；③采用Geneontology生物信息学软件（http：//pantherdb.org/）对差异表达蛋白质进行细胞成分、生物学途径和分子功能分析。 结果 ①鉴定了70个差异表达蛋白，其中37个蛋白在结肠癌间质中高表达，33个蛋白在结肠癌间质中表达降低；②从生物学途径、细胞成分、分子功能三个方面对差异表达蛋白质进行分析。 结论 ①首次采用iTRAQ标记定量蛋白质组学和LCM结合的方法筛查结肠癌间质差异表达蛋白质；②GO功能分析显示了差异表达蛋白质的细胞成分、分子功能以及生物学功能。

[关键词] 结肠癌；间质；激光捕获显微切割；iTRAQ标记定量蛋白组学；生物信息学

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（c）-0026-05

The application of LCM combined with iTRAQ quantitative proteomic technology in colon cancer

MU Yibing1 ZHANG Guiying2

1. Department of Gastroenterology， the fourth hospital of Changsha， Hunan Province， Changsha 410008， China； 2. Department of Gastroenterology， Xiangya Hospital Central South University， Hunan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To search differentially expressed proteins in colon cancer stroma （CS） by laser capture microdissection （LCM） combined with iTRAQ marker quantitative proteomic technique. Methods ①12 CS and adenocarcinoma tissues were selected as observation group， and normal mucosa （>10 cm away from adenocarcinoma） was selected as control group， the tissues were separated by LCM. ②iTRAQ quantitative proteomic technology was used to identified differentially expressed proteins（DEPs）.③ GENEONTOLOGY functional annotation（GO） was used for bioinformatics analysis （Cellular components， biological pathways and molecular functional analysis）. Results ①70 DEPs were identified in CS （37 upregulated and 33 downregulated）. ②The differentially expressed proteins were analyzed from three aspects： biological pathway， cell composition and molecular functio. Conclusion ① For the first time， 70 DEPs in CS by LCM and iTRAQ quantitative proteomic technology are identified. ② GO can be used to analysis the biology function of the 70 DEPs and provided important values to the pathology of colon cancer.

[Key words] Colon cancer； Stromal； Laser capturemicrodissection； iTRAQ-based quantitative proteomics； Bioinformatics analysis

腫瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视，现已成为当今肿瘤研究的一个热门话题。结肠癌是世界常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率位居欧美发达国家的第三位[1-2]。近年来，由于环境的恶化和饮食结构的调整，我国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升，严重危害了人民的生命和健康。目前，国内外对于结肠癌的研究多集中在结肠癌的癌细胞本身，但对于结肠癌微环境的研究较少。

本研究从肿瘤微环境的角度出发，对比研究结肠癌间质和正常结肠黏膜间质蛋白质表达谱的差异，首次采用激光捕获显微切割技术（laser capturemicrodissection，LCM）联合iTRAQ标记定量蛋白组学技术筛选结肠癌间质差异表达蛋白质。从蛋白质水平探讨结肠癌间质在肿瘤恶性化进程中的作用，初步探索结肠癌微环境所独有的特征，为寻找结肠癌诊断及治疗标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器 试剂：甲基绿、蛋白酶抑制剂、OCT组织包埋剂、十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、苯三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶、iTRAQ试剂（118，121），SCX强阳离子交换柱（Luna SCX 100A）、strata-X C18除盐柱。

仪器：Beckman L765超速离心机、徕卡CM1900冰冻切割机、激光捕获显微切割系统、CTR6000激光捕获显微切割仪、高效液相色谱仪（日本岛津公司）、microTOF-Q II质谱、UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF基质辅助激光解析飞行时间质谱。

1.1.2 标本采集及处理 12对结肠腺癌标本均来自中南大学湘雅医院普外科手术切除标本；其中男7例，女5例，患者平均年龄为（48±8）岁，临床分期按照DUKES分期分为A-D期。所有病例术前未接受放疗和化疗，并经病理学专家确诊。手术切除的新鲜结肠癌组织与配对结肠黏膜组织相距至少10 cm。每块组织取材1.0 cm×1.0 cm大小。取材后，迅速将标本置于液氮速冻30 min，然后超低温冰箱（-80℃）保存[3]。本研究经中南大学湘雅医院医学伦理委员会批准，且经过患者知情同意后进行。

1.2 方法

1.2.1 样本制备以及1D SPS-PAGE（一向聚丙烯酰胺凝胶电泳） 冰冻组织O.C.T包埋剂包埋，在Leica CM 1900冰冻切割机下切成8 μm厚连续冰冻切片后[4]。加入组织裂解液（7 mol/L Urea，4% chaps，5 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L EDTA，100 mmol/L DTT），充分混合，4℃裂解1 h，Ultrasound 5 min（冰上），离心（20 000 g， 25 min），取上清。上清加入DTT至终浓度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入1 AM至终浓度55 mmol/L，暗室静置1 h。然后加入预冷丙酮（体积为4×样本溶液体积），沉淀3 h（-20℃），离心（20 000 g，4℃）20 min，取沉淀。然后加入复溶缓冲液300 μL，终浓度为50%TEAB，0.1%SDS。20 000 g，4℃，超声3 min助溶，用Bradford法测定蛋白质的浓度，-80℃保存备用，并进行一向聚丙烯酰胺凝胶电泳[4]。

1.2.2 iTRAQ标记蛋白质 118，121各标记试剂中分别加入异丙醇70 μL，充分混合均匀。在结肠癌间质或正常结肠间质中分别加入iTRAQ试剂（结肠癌间质：iTRAQTM reagent 118；正常結肠间质：iTRAQTM reagent 121），混匀，室温下孵育2 h，每管加入100 μL超纯水，终止iTRAQ标记反应，室温下孵育30 min，将被标记的所有样品混合混匀，冷冻干燥。然后，将各样本进行强氧离子交换色谱（HPLC）分离、C18反相色谱除盐。

1.2.3 质谱检测 用microTOF-QII（Bruker.Daltonics，Germany）检测肽段信号。质谱分析采用信息依赖性获取模式（information dependent acquisition mode，IDA）。实验重复3次。差异表达蛋白质筛选需同时满足下列条件[5]：①蛋白的鉴定有两个或两个以上独特肽段；②两组间比值≥1.3或≤0.667。

1.2.4 Geneontology在线软件进行生物信息学分析 为了对差异蛋白质的生物信息学有一个全面的认识，进行蛋白质GO分析。采用GO分析软件GENEONTOLOGY生物信息学软件（http：//pantherdb.org/）分别从生物学途径（GO_BP）、细胞成分（GO_CC）和分子功能（GO_MP）3个方面注释。

2 结果

2.1 蛋白质谱鉴定及分析

筛选到70个差异表达蛋白质（表1），其中37个蛋白在结肠癌间质中高表达，33个蛋白在肿瘤间质中表达降低。这些差异表达蛋白质所涉及的功能分类主要有细胞外基质、细胞骨架蛋白、内质网应激、代谢、炎性反应等。

2.1.2 生物信息学分析 本实验中鉴定间质差异表达蛋白质共70个，从生物学途径、细胞成分、分子功能3个方面对差异表达蛋白质进行分析。

按照分子功能注释，47.2%的差异蛋白属于binding蛋白，包括DNA binding、RNA binding、核酸binding、GTP binding等；30.6%具有催化活性，17.0%的蛋白具有分子结构调节活性，转运活性蛋白占2.8%，受体活性蛋白占2.8%，可能与这些蛋白的丰度较低有关。见图1。

按照生物学途径分类，参与生理调节的蛋白占25.0%，参与细胞代谢的蛋白占19.7%，参与细胞合成的蛋白占17.1%，与其他细胞及组织发生相互作用的的蛋白占10.5%，参与免疫调节、应激反应等蛋白所占比例较少。见图2。

按照细胞成分注释，这些差异表达蛋白质中的大多数属于细胞内蛋白，其中细胞器蛋白占27.3%，细胞膜蛋白占2.3%，细胞连接蛋白占2.3%，细胞外基质占2.3%，细胞外蛋白占11.4%。见图3。

3 讨论

肿瘤微环境，即肿瘤细胞生长和生活的内环境，它由许多间质细胞组成，包括成纤维细胞、免疫和炎性细胞、脂肪细胞、胶质细胞、平滑肌细胞以及一些血管细胞等[6]。近年来有研究发现，间质细胞在肿瘤发生发展的进程中起着重要的促进作用，间质细胞可以通过产生细胞趋化因子、生长因子和基质降解酶从而促进血管生成和基底膜破坏，使肿瘤的侵袭能力增强[7-8]。对比研究肿瘤间质细胞与正常组织间质细胞的差别，将有助于发现肿瘤微环境所独有的特征。

因此，本研究首次采用LCM技术从新鲜的手术[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（4）：439-450..

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（收稿日期：2016-11-15 本文編辑：李岳泽）