程瑞斌+刘静

（咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院 检验科，湖北咸宁 437100）

[摘 要] 目的：分析基因芯片检测乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）分型和耐药突变的准确度灵敏度，探讨其临床应用价值。方法：以我院2014年5月至2016年9月确诊且符合入组标准的351例乙型病毒性肝炎患者为研究对象，采用基因芯片法检测其血清标本HBV基因分型及核苷酸类药物突变情况，以DNA直接测序法为金标准，计算基因芯片检测HBV分型和耐药突变的准确度灵敏度。结果：基因芯片与基因测序检测HBV分型、耐药突变结果完全一致。以基因测序检测结果为金标准，基因芯片检测HBV分型和耐药突变的准确度为100%；基因芯片检测HBV分型和耐药的最低检出限为103 copies/mL。结论：基因芯片技术在HBV分型和耐药突变的检测中具有较高的准确度及灵敏度，能够为临床抗病毒药物的选择提供可靠的参考。

[关键词] 基因芯片；乙肝病毒分型；耐药突变；准确度；灵敏度

中图分类号：R446.1 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2017）04-062-03

DOI：10.11876/mimt201704025

安全、有效的抗病毒治疗对于延缓乙型病毒性肝炎病情进展具有重要意义[1]。然而，HBV包括多种基因型，不同基因型耐药特点存在差异，耐药严重影响了抗病毒治疗效果[2]。当前临床明确HBV耐药突变检测的金标准为DNA直接测序法，但存在成本高、耗时久等弊端，无法满足快速诊断、大规模推广要求[3]。本研究就基因芯片检测HBV分型及耐药突变的准确度及灵敏度进行分析，旨在评估该技术的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以我院2014年5月—2016年9月参照2010年全国传染病与寄生虫病学术会议拟定的《病毒性肝炎防治方案》确诊的乙型病毒性肝炎患者为研究对象。入组患者乙肝表面抗原（HBsAg）及HBV DNA检测均为阳性（HBV DNA≥1×103 IU/mL），排除合并其他类型肝炎及免疫性肝病、胆汁型肝硬化患者及基因芯片检测无信号者[4]共351例入选。其中男189例，女162例，年龄17～71岁，平均年龄（48.42±10.58）岁。351例患者均有长期（≥48周）核苷类抗病毒药物使用史，其中208例接受拉米夫定治疗，143例接受阿德福韦酯治疗。本研究已征得我院医学伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 抽取患者入组次日空腹静脉血4 mL，分装于4支抗凝管内，分别用于基因芯片法HBV基因分型、耐药突变检测及基因测序法HBV基因分型、耐药突变检测。

1.2.2 标本检测 基因芯片：HBV基因分型及耐药突变检测试剂均购自深圳亚能生物技术有限公司，使用Biomctra基因扩增仪及FYY-3型分子杂交仪（兴化市分析仪器厂），操作均严格按照试剂使用说明书。扩增循环条件：95℃ 10 min→94℃ 34 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，重复循环50次。结果分析使用光学扫描仪[5]。HBV膜条探针排列顺序设计见表1。基因测序：取第二次聚合酶链反应（PCR）扩增产物，委托华大基因公司完成基因测序。

1.2.3 结果分析 根据基因芯片、基因测序检测结果，分析患者HBV分型及耐药突变，以基因测序检测结果为金标准，计算基因芯片检测HBV分型及耐药突变的准确度、灵敏度及特异性[6]。此外，为验证基因芯片对HBV分型和耐药检测的准确性，应用实时定量PCR法确认标本载量并制成104、103、102 copies/mL浓度，分析基因芯片的最低检出限[7]。

2 结果

基因芯片与基因测序检测HBV分型结果完全一致，均为B型211例、C型53例、B+C型87例。基因芯片准确度100%。

351例患者中有126例患者耐药基因突变耐药，基因芯片与基因测序检测HBV耐药突变结果相同，具体见表2，准确度为100%。

以基因测序检测结果为金标准，基因芯片检测HBV分型和耐药突变的灵敏度及特异性均为100%；基因芯片检测HBV分型和耐药的最低检出限为103 copies/mL。

3 讨论

核苷类似物是临床治疗病毒性乙型肝炎的常用方案，其口服给药方便、病毒抑制作用较强等优势已得到广泛认可，且可用于肝功能失代偿者，但该类抗病毒药物HBeAg转换率偏低，疗效持久性不足，会导致部分患者出现耐药现象[8-9]。HBV耐药突变的发生，可造成HBV DNA再次升高、转氨酶反弹等，对治疗效果造成不良影响 [10]。与此同时，不同HBV基因型对干扰素的应答、疾病进程的影响存在差异[11]，因此，在明确HBV耐药突变的同时，了解HBV分型对于指导治疗方案的选择亦有着重要意义。

当前临床判断HBV分型与耐药突变主要依据基因测序技术，目前该技术耗时久、操作烦琐且成本高昂 [12]。作为一种新型生物芯片技术，基因芯片检测主要根据分子间特异性相互作用的原理，通過集成于硅芯片或玻璃芯片内微型生化分析系统，全面了解基因及其他生物组分信息，具有准确、快速、信息量大的优势[13]。与传统检测手段相比，基因芯片技术具有无污染、成本低、自动化、微型化等特点，且可检测已知突变位点，故在HBV分型和耐药突变方面有着良好的应用前景[14]。

为明确基因芯片技术检测HBV分型与耐药突变的价值，本研究结果表明，基因芯片与测序在HBV分型和耐药突变的检测准确度方面具有一致性，这主要得益于HBV耐药变异基本为单碱基变异，而寡核苷酸基因芯片技术在单次检测中即可明确与HBV耐药性相关的单碱基变异，一般不会导致误判或漏检[15-16]。

本研究筛选过程中8例患者因基因芯片无信号而未入组，无信号的原因可能是由于DNA拷贝数低于基因芯片的最低极限。在灵敏度的分析中，最低检出限亦为重要指标。本研究制成不同阶梯浓度的标本，就基因芯片技术的最低检出限进行了分析，结果表明，该技术最低检出限可达103 copies/mL，显现出其在检测灵敏度方面较高的价值。

需要注意的是，由于基因芯片技术仅可检测已知位点的耐药变异，无法发现新的变异位点并针对性设计引物与探针，故在了解易突变区域完整序列、发现新的耐药突变位点方面存在不足[18]。随着临床对于HBV耐药突变研究的不断深入，以及更多新的耐药位点的探索，基因芯片技术在HBV耐药突变检测环节的应用价值有望得到显著提高，但仍无法完全取代基因测序技术。

参 考 文 献

[1] Honda M， Shirasaki T， Terashima T， et al. Hepatitis B Virus （HBV） Core-Related Antigen During Nucleos （t） ide Analog Therapy Is Related to Intra-hepatic HBV Replication and Development of Hepatocellular Carcinoma[J]. J Infect Dis， 2016， 213（7）： 1096-1106.

[2] Lei P， Li Y， Zhang J， et al. Gene Chip-based Screening of Differentially Expressed Genes in Human Injured Cerebral Cortex[J]. Neurosurg Q， 2015， 25（1）： 41-45.

[3] 王运照， 胡文忠， 李婷婷， 等. 基因芯片在微生物检测中的应用及发展概况[J]. 食品工业科技， 2015， 36（15）： 396-400.

[4] 唐向荣. 乙型肝炎病毒基因检测芯片的研制及临床研究[D].上海：中国科学院上海微系统与信息技术研究所， 2008.

[5] Bard-Chapeau E A， Nguyen A T， Rust A G， et al. Transposon mutagenesis identifies genes driving hepatocellular carcinoma in a chronic hepatitis B mouse model[J]. Nat Genet， 2014， 46（1）： 24-32.

[6] Mimura I， Kanki Y， Kodama T， et al. Revolution of nephrology research by deep sequencing： ChIP-seq and RNA-seq[J]. Kidney Int， 2014， 85（1）： 31-38.

[7] 蒋贝， 戴晨阳， 李秀梅， 等. 基于PCR测序技术的HBV感染者耐药突变临床分析[J]. 中华肝脏病杂志， 2016， 24（1）： 36-39.

[8] Su I J， Wang L H C， Hsieh W C， et al. The emerging role of hepatitis B virus pre-S2 deletion mutant proteins in HBV tumorigenesis[J]. J Biomed Sci， 2014， 21（1）： 1.

[9] Wang D Y， Zou L P， Liu X J， et al. Hepatitis B virus X protein induces the histone H3 lysine 9 trimethylation on the promoter of p16 gene in hepatocarcinogenesis[J]. Exp Mol Pathol， 2015， 99（3）： 399-408.

[10] Niu J X， Meng X K， Ren J J. Studied microRNA gene expression in human hepatocellular carcinoma by microRNA microarray techniques[J]. World J Gastroenterol， 2015， 21（44）： 12605.

[11] 张玉华. 干扰素对不同基因型HBV抗病毒疗效的差异[D]. 哈尔滨：哈尔滨医科大学， 2013.

[12] Qu L S， Jin F， Guo Y M， et al. Nine susceptibility loci for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma identified by a pilot two-stage genome-wide association study[J]. Oncol Lett， 2016， 11（1）： 624-632.

[13] 胡婷婷， 陈宇明， 关明， 等. 乙型肝炎病毒耐药基因测序检测性能验证[J]. 中华检验医学杂志， 2014， 37（10）： 776-779.

[14] Kohno T， Tsuge M， Murakami E， et al. Human microRNA hsa‐miR‐1231 suppresses hepatitis B virus replication by targeting core mRNA[J]. J Viral Hepat， 2014， 21（9）： 89-97.

[15] 曾勇彬， 刘灿， 欧启水， 等. 建设HBV耐药突变和基因分型实验诊断平台[J]. 中华检验医学杂志， 2014， 37（2）： 87-89.

[16] Pourkarim M R， Amini-Bavil-Olyaee S， Kurbanov F， et al. Molecular identification of hepatitis B virus genotypes/subgenotypes： revised classification hurdles and updated resolutions[J]. World J Gastroenterol， 2014， 20（23）： 7152-7168.

[17] Chai X， Han Y， Yang J， et al. Identification of the transcriptional regulators by expression profiling infected with hepatitis B virus[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol， 2016， 40（1）： 57-72.

[18] Rodrigues R M， Sachinidis A， De Boe V， et al. Identification of potential biomarkers of hepatitis B-induced acute liver failure using hepatic cells derived from human skin precursors[J]. Toxicol In Vitro， 2015， 29（6）： 1231-1239.

第一作者：程瑞斌，大專，检验主管技师，研究方向：检验临床，Email：chengruibin@sina.com。