王冬梅 ,郭书贤 ,梁跃辉 ,刘 欢 ,张艳平

(1.南阳理工学院生物与化学工程学院,河南 南阳 473000； 2.南阳市工业微生物重点实验室,河南 南阳 473000；3.车用生物燃料技术国家重点实验室, 河南 南阳 473000； 4.海南大学食品学院,海口 570100)

生物工程

酵母菌发酵啤酒生产废水产微生物油脂和菌体蛋白的研究

王冬梅1,2,郭书贤1,2,梁跃辉1,刘 欢3,张艳平4

(1.南阳理工学院生物与化学工程学院,河南 南阳 473000； 2.南阳市工业微生物重点实验室,河南 南阳 473000；3.车用生物燃料技术国家重点实验室, 河南 南阳 473000； 4.海南大学食品学院,海口 570100)

为探索啤酒生产废水综合利用的方法和途径，采用液体发酵的方法，从7个酵母菌株中筛选出既能产微生物油脂和菌体蛋白，又能有效降解COD的菌株。考察了优良酵母菌株的发酵周期，并对其所产油脂的脂肪酸组成和菌体蛋白的氨基酸组成进行分析。结果表明：6#菌株——TrichosporonporosumD02、1#菌株——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809对废水的资源化利用程度最高，6#和1# 2个优良酵母菌株在发酵120 h时的油脂产量、菌体粗蛋白产量、COD降解率分别达到8.93 g/L、6.1 g/L、89.09%和4.62 g/L、4.42 g/L、81.47%。2个优良酵母菌株所产油脂的脂肪酸组成均以C16和 C18系为主，含量最高的为油酸(C18∶1)和棕榈酸(C16∶0)，不饱和脂肪酸指数(IUFA)分别达到80.33%和61.57%。除脯氨酸未检出外，2个优良酵母菌株菌体蛋白均含有17种氨基酸，其中8种必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别为44.14%和44.23%，可完全充当动物蛋白饲料。

啤酒生产废水；产油脂酵母；微生物油脂；菌体蛋白；COD；脂肪酸组成；必需氨基酸

从2003年起，我国啤酒产销量均为世界第一， 并保持连续增长[1]。与此同时，啤酒企业每年要投入大量费用用于处理生产废水[2]。由于啤酒生产废水含有较高浓度的有机物、N、P、无机盐等营养物质，直接处理会造成资源的浪费。目前，研究者对资源化利用啤酒生产废水进行了有益的探索[3-6]，但啤酒生产废水的综合利用仍是尚未解决的实际难题，是当今环保领域亟待研究的课题之一。为探讨啤酒废水资源化利用的有效途径，笔者在前期研究基础上[7-9]，对7种酵母菌利用啤酒废水发酵进行了筛选，考察了酵母菌株对啤酒废水COD降解率、产微生物油脂和产菌体蛋白能力的影响，以期为实现啤酒生产废水的资源化利用探索新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株(见表1)

表1 实验菌株

1.1.2 培养基

(1)活化培养基为YEPD固体培养基[7]：葡萄糖20 g/L，酵母膏或酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂20 g/L，自然pH。于121℃饱和蒸汽灭菌20 min。

(2)种子培养基为YEPD液体培养基[7]：葡萄糖20 g/L，酵母膏或酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH。于121℃饱和蒸汽灭菌20 min。

(3)发酵培养基：自然沉降24 h的啤酒生产废水(南阳天冠啤酒厂)，以1∶1稀释后调节其pH为5.8～6.0。于121℃饱和蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 实验试剂

酵母粉(BR)、蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、琼脂(BR)、硫酸铜(AR)、硫酸钾(AR)、硼酸(AR)、氢氧化钠(AR)、苯酚(AR)、浓盐酸(AR)、浓硫酸(AR)、3,5-二硝基水杨酸(AR)、无水乙醇(AR)、硫酸亚铁铵(AR)、硫酸汞(AR)、七水硫酸镁(AR)、甲醇(AR)、三氯甲烷(AR)、重铬酸钾(AR)、邻苯二甲酸氢钾(AR)等。

1.1.4 实验仪器

SW-CJ-2G超净工作台；HZQ-B大型全温摇床；752N紫外-可见分光光度计；TDL-40B低速离心机；TDL-40B高速离心机；DNP-9082电热恒温培养箱；101-2A电热鼓风干燥箱； LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌锅； PHS-3C精密pH计；-20℃冰箱；日立L-8900 全自动氨基酸分析仪，日立株式会社；天美TM 7890ⅡGC气相色谱仪附氢火焰离子化检测器(FID)，上海天美分析仪器有限公司；浙江大学T2100色谱工作站，浙江大学智能信息工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

接1环保藏菌株至YEPD固体斜面培养基，28℃恒温箱中培养3～4 d。接适量活化后的菌体于YEPD液体种子培养基中(250 mL锥形瓶中装液量为50 mL)，28℃、120 r/min培养36～48 h。然后把种子培养液按10%的接种量接种于发酵培养基中(500 mL锥形瓶中装液量为100 mL)，28℃、120 r/min摇床培养120 h。

1.2.2 测定方法

(1)菌体生物量的测定：采用干重法[10]测定菌体生物量。

(2)油脂的测定：采用酸热法[11]提取微生物油脂。

油脂产量=提取油脂的质量/发酵液体积

油脂含量=提取油脂的质量/发酵液生物量×

100%

油脂系数=消耗100 g糖转化为油脂的质量

(3)总糖的测定：采用苯酚-硫酸法[11]测定总糖。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，Y=0.001 01+0.008 49X，R2=0.998 4。

(4)还原糖的测定：采用3、5-二硝基水杨酸(DNS)法[12]测定还原糖。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，Y=-0.006 1+0.499 43X，R2=0.999 7。

(5)总氮的测定：采用凯氏定氮法[13]测定总氮。

菌体粗蛋白产量=粗蛋白质量/发酵液体积

干菌粗蛋白含量=粗蛋白质量/干菌体质量×100%

蛋白系数=消耗100 g糖转化为蛋白质的质量

(6)COD的测定：采用重铬酸钾法[14]测定COD。

(7)pH的测定：采用PHS-3C精密pH计测定pH[15]。

(8)菌体蛋白氨基酸组成的测定：采用GB/T 18246—2000茚三酮分光光度法测定氨基酸组成。

(9)菌体油脂脂肪酸组成分析：待测样品甲酯化。色谱柱为TM石英毛细管柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：150 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至190 ℃后保持5 min；汽化温度280℃；进样量0.3 μL；检测器(FID)温度280℃；燃气(H2)流速20 mL/min；载气(N2)流速90 mL/min；助燃气(空气)流速60 mL/min；分流比1∶10。脂肪酸通过对照标准品定性，用面积归一化法[6]确定相对含量。

(10)不饱和脂肪酸指数(IUFA)计算：参照文献[16]。

2 结果与分析

2.1 不同酵母菌利用啤酒废水的产油脂能力

以啤酒生产废水为培养基，分别将7个菌株用1.2.1的方法进行培养，测定其生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数，结果见表2。

由表2可以看出，在接种量、培养时间、培养温度、摇床转速等相同的条件下，不同菌株的产油脂能力不同。6#菌株的油脂产量、油脂含量最高，其次是1#菌株，其油脂含量达31.99%； 2#、5#和7#菌株的油脂含量均在20%以上；而3#和4#菌株的油脂含量较低，分别只有15.38%和17.07%。以菌体生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数指标综合来考虑，可以确定6#和1#菌株在啤酒废水中产油能力最好。

表2 不同菌株产油脂能力的比较

2.2 不同酵母菌利用啤酒废水产菌体蛋白能力

以啤酒生产废水为培养基，分别将7个产油脂酵母菌株按1.2.1的方法培养，测定其生物量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和蛋白系数，结果见表3。

表3 不同酵母菌株产菌体蛋白能力的比较

由表3可见，在相同的培养条件下，不同菌株的产菌体蛋白能力有显著的差异，不同酵母菌株的干菌粗蛋白含量也不相同。1#和6#菌株的干菌粗蛋白含量最高，分别达到30.64%和29.15%；其次3#、5#和7#菌株的干菌粗蛋白含量为20%以上，2#和4#菌株的干菌粗蛋白含量最低， 只有16%左右。以菌体生物量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和蛋白系数为指标进行综合考虑，1# 、5#和6#菌株利用啤酒生产废水产菌体蛋白能力较好。

2.3 不同酵母菌处理啤酒废水的COD降解率

以啤酒生产废水为培养基，分别将7个菌株用1.2.1的方法进行培养，测定其COD降解率，结果见图1。由图1可以看出，在相同的培养条件下，不同菌株对废水的COD降解率不同。6# 和7#菌株对废水的COD降解率最高，分别达到89.09%和89.67%；其次1# 和2#菌株分别为81.47%和79.83%；3# 、4#和5#菌株对废水的COD降解率较低，均在60%以下。

图1 不同酵母菌株对废水COD降解率

综上所述，通过对7个不同酵母菌株利用啤酒生产废水产油脂能力、产菌体蛋白能力和对废水COD降解率的考察，6# 和1#菌株的各项指标较好，可以确定为啤酒生产废水资源化利用的优良酵母菌株。6# 和1#产油脂酵母菌株在啤酒生产废水中发酵后菌体和脂肪球形态，见图2。

2.4 6#和1#菌株发酵周期分析

利用不添加任何营养成分的啤酒生产废水为培养基，分别将筛选出的6#菌株和1#菌株用1.2.1的方法进行培养，每24 h取样，测定各项发酵指标，结果分别见表4和表5。

表4 发酵时间对6#菌株产油脂的影响

表5 发酵时间对1#菌株产油脂的影响

由表4和表5可以看出，6#菌株和1#菌株的发酵过程可分为菌体生长期和油脂积累期。6#菌株和1#菌株在培养的前72 h，菌体生长旺盛，菌体生物量有较大增幅，COD降解率也有较大提高，而油脂积累较少；6#菌株在培养96 h时，菌体的油脂系数和油脂含量达到最大，分别为14.79和44.98%，随着培养时间的延长，在120 h菌体油脂产量达到最大值、生物量和COD降解率接近最高值，分别为8.93、20.94 g/L和89.09%，而油脂含量和油脂系数却略有降低。1# 菌株在发酵120 h时，菌体生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数和COD降解率均基本达到最高值，分别为14.44 g/L、4.62 g/L、31.99%、13.76和81.47%。在培养120 h后，由于营养物质的大量消耗，6#菌株和1#菌株的发酵进入衰亡期，菌体油脂产量、油脂含量和油脂系数均有所降低，但COD降解率却没有明显变化。因此，经过综合分析，可以确定6#和1# 菌株的适宜发酵周期为120 h。

2.5 6#和1#菌株产油脂的脂肪酸组成和菌体蛋白的氨基酸组成分析

以啤酒生产废水为培养基，在10%的接种量、100 mL的装液量、28 ℃、120 r/min的条件下对6#和1#菌株培养120 h，发酵结束后收集菌体并进行干燥，提取微生物油脂，利用气相色谱对其脂肪酸组成进行分析，结果见表6。并依据GB/T 18246—2000的检测方法，利用氨基酸自动分析仪测定菌体蛋白的氨基酸含量，结果见表7。

表6 利用啤酒生产废水培养6#和1#菌株

注：“-”为未检出。下同。

由表6可以看出，6#和1#菌株产油脂的脂肪酸组成均以C16和C18系列为主，脂肪酸相对含量最高的是油酸(C18∶1)和棕榈酸(C16∶0)，分别为61.57%、22.20%和58.86%、34.38%，不饱和脂肪酸指数分别达到80.33%和61.57%，均与植物油的脂肪酸组成相似，可作为生物柴油新油源。

表7 利用啤酒生产废水培养6#和1#菌株产菌体蛋白的氨基酸组成分析 %

由表7可以看出，6#和1#菌株菌体蛋白在18种氨基酸中只有脯氨酸未被检出，其中8种必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别达到44.14%和44.23%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.790和0.793。由此可以看出，6#和1#菌株菌体蛋白中必需氨基酸含量高于常见的蛋白饲料，且还普遍高于常见的肉类食物，完全达到了FAO/WHO 40%的要求，完全可以充当动物的蛋白饲料。

3 结 论

(1)从7个酵母菌株筛选出资源化利用啤酒生产废水程度较高的2个优良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809，培养120 h时，2个优良菌株的生物量、油脂产量、油脂含量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和COD降解率依次分别为20.94 g/L、8.93 g/L、42.65%、6.1 g/L、29.15%、89.09%和14.44 g/L、4.62 g/L、31.99%、4.42 g/L、30.64%、81.47%，2个酵母菌株利用啤酒工业废水的综合发酵效果较好。

(2)2个优良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809利用啤酒生产废水产菌体油脂的脂肪酸组成均以C18和C16系列为主，脂肪酸相对含量最高的是油酸(C18∶1)和棕榈酸(C16∶0)，分别为61.57%、22.20%和58.86%、34.48%，不饱和脂肪酸指数分别达到80.33%和61.57%，与植物油的脂肪酸组成相似，可作为生物柴油新油源。

(3)2个优良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809利用啤酒生产废水产菌体粗蛋白的氨基酸组成除脯氨酸未被检出，其余17种氨基酸均被检出。其中8种必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别达到44.14%和44.23%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.790和0.793。6#和1#菌株菌体蛋白中必需氨基酸含量与常见的蛋白饲料相比要高，并且普遍高于常见的肉类食物，达到了FAO/WHO 40%的要求，完全可以充当动物饲料，其营养成分甚至达到了食品的要求。

(4)啤酒生产废水中的营养物质可利用性较高，采用优良产油脂酵母菌对废水进行处理，不仅可以极大降低啤酒废水中的COD，同时还可以获得高附加值的微生物油脂和菌体蛋白等产品，这为探索实现废水的综合资源化利用提供了新的途径和依据。

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Production of microbial oil and bacterial protein from beer production wastewater fermented by yeast

WANG Dongmei1,2,GUO Shuxian1,2,LIANG Yuehui1, LIU Huan3, ZHANG Yanping4

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473000, Henan,China； 2.Nanyang Key Laboratory of Industrial Microbiology, Nanyang 473000, Henan,China； 3.State Key Laboratory for Automotive Biofuel, Nanyang 473000, Henan,China; 4.College of Food, Hainan University, Haikou 570100,China)

For exploring the comprehensive utilization method and way of beer production wastewater, using the liquid fermentation to select high-yield strains which could product microbial oil, bacterial protein and could effectively degrade COD from seven yeast strains were studied. The fermentation period was examined and the fatty acid composition of microbial oil and amino acid composition of bacterial protein of the screened yeast strains were analyzed. The results showed that the resource utilization degrees of 6# strain (TrichosporonporosumD02) and 1# strain (Lipomycesstarkeyi1809) on wastewater were the highest. When two screened strains 6# strain and 1# strain were fermented for 120 h, the oil productivity, crude bacterial protein productivity and degradation rate of COD were 8.93 g/L, 6.1 g/L, 89.09% and 4.62 g/L, 4.42 g/L, 81.47% respectively. C18and C16fatty acids were the main components in the fatty acid composition of microbial oil of two screened strains. The contents of oleic acid and palmitic acid were the highest. The indexes of unsaturated fatty acid (IUFA) were 80.33% and 61.57% respectively. Except proline was not detected, the bacterial protein of two screened strains contained 17 kinds of amino acids and the contents of eight kinds of essential amino acids were 44.14% and 44.23% respectively. Bacterial protein could be used as a new source of animal protein feed.

beer production wastewater; oleaginous yeast; microbial oil; bacterial protein;COD;fatty acid composition; essential amino acid

2016-05-26；

2017-01-03

河南省基础与前沿技术研究项目(132300410087)；河南省重点科技攻关计划项目(102102310033)

王冬梅(1964)，女，教授，硕士，研究方向为食品生物技术(E-mail)Wdm0410@sohu.com。

郭书贤，教授(E-mail)guoshux@163.com。

TS222;TQ920.6

A

1003-7969(2017)04-0108-06