熊文海　凌万旭　颜洪奎　何锦

摘要：云南省某养殖场饲养母猪260多头，所产仔猪近期有20%左右发病，发病时间已达2个多月，部分仔猪出生第2天发病，主要症状表现为腹泻，拉黄色粪便，同养殖场肥猪、保育猪均表现正常。为诊断仔猪患病情况，为综合防控提供支持，对该场送检的3头病仔猪进行病理剖检，采集组织用PCR技术进行病原检测。检测结果为1号猪猪圆环病毒2型抗原检测呈阳性，3头仔猪猪轮状病毒抗原检测呈阳性，说明该生猪养殖场发生了猪圆环病毒2型与猪轮状病毒的混合感染。通过对该养殖场母猪、仔猪进行免疫接种，发病仔猪隔离治疗、加强养殖场饲养管理等措施，最终控制了猪圆环病毒2型与猪轮状病毒混合感染的疫情。

关键词：仔猪腹泻；猪圆环病毒2型；猪轮状病毒；混合感染；PCR诊断

中图分类号：S828 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132061

前言

猪轮状病毒（RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）双股RNA病毒。猪轮状病毒病为急性肠道传染病，临床上表现为哺乳仔猪和断奶前、后仔猪呕吐、腹泻、脱水体重减轻为特征的急性肠道传染病。该病在全世界各地猪场均有发生，多发生于晚秋、冬季和早春，呈地方性流行，轮状病毒感染是断奶前后仔猪腹泻的重要原因，初期病猪表现为沉郁、食欲不振和不愿活动，之后不久会发生严重腹泻，粪便呈水样或糊状，黄白色或暗黑色，严重脱水、消瘦、体重减轻30%。本病症状的轻重受发病猪日龄、环境条件以及免疫状况等的影响，一周龄以内的仔猪受母源抗体的保护，不易发病，但如果缺乏有效的母源抗体保护，10日龄内的仔猪发病症状严重，严重时病死率可达100%。病猪剖检时可见猪小肠胀气，肠内容物呈棕黄色水样，肠壁菲薄呈半透明状，有时可见小肠弥漫性出血，胃中有未消化凝乳块。

猪圆环病毒病（PVCD）是近年来发现的一种较难控制的病毒性传染病，该病由猪圆环病毒2型（PCV-2）引发。该病不同年龄阶段的猪均可感染，该病主要侵害哺乳仔猪和育肥猪及怀孕母猪。临床表现为猪高热、呼吸困难、咳嗽、肠炎，母猪表现为繁殖障碍等。其引起的疫病包括猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS），增生性坏死性肺炎（PNP）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等。该病的主要病理变化为：贫血、黄疸、淋巴结异常肿胀，内脏和外周淋巴结肿大到正常体积的3～4倍，切面为均匀的白色，肺部有灰褐色炎症和肿胀，肝脏发暗、萎缩、肾脏水肿、脾脏轻度肿大，胰、小肠、结肠也常有肿大及坏死病变。猪圆环病毒病为免疫抑制性疾病，常引发其他病原混合感染和继发感染。如猪圆环病毒2型与猪瘟混合感染、猪圆环病毒2型与猪附红细胞体混合感染等，而猪圆环病毒2型与猪轮状病混合感染却不常见。

云南某生猪养殖场共养殖母猪260多头，所产仔猪近期有20%左右发病，发病时间已达2个多月，发病猪死亡率不高，仔猪从出生的第2天发病，主要症状表现腹泻，拉黄色粪便，仔猪断奶后病情有所好转。同养殖场大猪、保育猪均表现正常。

2016年9月1日，云南省某生猪养殖场把3头腹泻仔猪送往云南農业大学做检测，根据腹泻仔猪临床症状、病理解剖结果、养殖场流行病学调查和实验室PCR检测结果，最终确诊该养殖场哺乳仔猪腹泻由猪圆环病毒2型与猪轮状病毒混合感染引发，根据诊断结果养殖场立即采取防控措施，7d后病情被控制，14d后疫情完全平息，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料的来源

1.1.1病猪病料

来源于云南省某生猪养殖场送检3头腹泻仔猪，由实验室解剖并无菌采取仔猪的肺脏、肾脏、肝脏，小肠内容物。3头仔猪组织样品分别编号1号、2号、3号。

1.1.2试剂

RNAiso PlusTotalRNA购自大连宝生物生物技术有限公司；Bioteke细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购至北京百泰克生物技术有限公司；RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix、2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司；异丙醇、75%乙醇、琼脂粉、TAE缓冲液、双蒸水、氯仿等由实验室提供。

1.2临床观察及病理解剖

对送检的3头腹泻仔猪进行临床症状观察，并向养殖场户主详细了解发病情况，实验室剖检3头腹泻仔猪，详细记录剖检变化并取材保存。

1.3PCR检测

1.3.1引物

本次检测7个病原特异性引物均由云南农业大学动科院动物传染病实验室设计，特异性引物片段长度为：猪瘟病毒234bp、猪蓝耳病毒330bp、猪圆环病毒701bp、猪伪狂犬病毒500bp、猪流行性腹泻病毒为471bp、猪传染性胃肠炎病毒439bp、猪轮状病毒374bp。引物由上海生工（生物）有限公司合成。

1.3.2样品DNA/RNA提取

用Trizol法提取样品组织中的总RNA，实验过程严格按照操作说明进行；病毒DNA的提取按照百泰克生物技术有限公司的DNA快速提取试剂盒提取，实验过程严格按照操作说明进行。

1.3.3PCR扩增目的片段

提取的RNA利用北京全式金公司的反转录试剂盒（货号AE301-02）反转录得到cDNA，并以eDNA为模板，利用特异性引物分别进行猪瘟、蓝耳、猪流行性腹泻、传染性胃肠炎及轮状病毒PCR扩增。提取的DNA利用北京全式金公司的试剂盒（货号AS131-02），利用特异性引物进行猪圆环、猪伪狂犬病毒PCR扩增。

1.3.4目的基因片段PCR扩增

将上述提取出来的样品RNA利用特异性引物对其进行RT-PCR扩增，反转录体系如下2×ES Reaction Mix（含10×RTBuffer，dNTPs）5uL，EasyScriptTMⅡRT/RIEmzyme Mix（含Rnase Inhibitor，反转录酶）0.5uL，下游引物1uL，模板RNA 3.5uL，反应体系为10uL。将配制好的体系置于42℃反应30min，之后85℃反应5min。反转录产物置于4℃保存备用。将上述反转录产物及提取出来的样品DNA利用特异性引物对其进行PCR扩增，PCR扩增体系为：Mix（含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq酶）12.5 uL，dH20 10.5 uL，上下游引物各0.5 uL，DNA 1 uL，总反应体系为25 uL。PRRSV扩增反应条件为：94℃3 min；94℃1 min，65℃1 min，72℃1 min，40个循环；72℃5 min。PCV、RV、TGEV、PEDV扩增反应条件同PRRSV。

CSFV第1轮扩增反应条件为：94℃5min；94℃30sec，53℃45sec，72℃50sec，34个循环；72℃5min。将所得到的第1轮产物稀释300倍后，进行第2轮扩增，反应条件为：94℃5 min；94℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 40sec，34个循环；72℃ 5 min。

取上述PCR扩增产物10 μL配制成体系后加样到1.5%琼脂糖凝胶（含0.2%EB）孔中，并在120V电压下进行30min的电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并拍照。

1.4治疗方法

根据诊断结果采取特异性防控措施和综合性防控措施相结合的方法。方法如下。

1.4.1加强养殖场饲养管理

新生仔猪及时饲喂初乳，注意仔猪防寒保暖；断奶仔猪提供全价饲料，提高抵抗力；保证畜舍内通风，防止饲养密度过大；做好卫生消毒工作，严格控制人员、猪只流动，畜舍外每天采用3%火碱进行消毒，畜舍内使用高效且刺激性小的消毒威等消毒液加大稀释倍数进行带猪消毒。

1.4.2做好免疫接种工作

对该养殖场母猪、哺乳仔猪、断奶仔猪进行猪轮状病毒弱毒苗、猪圆环病毒弱毒苗紧急免疫接种。

1.4.3发病猪的治疗与处理

对于发病仔猪，采取隔离措施，并对腹泻物污染的设备、饲料等进行严格消毒；停止饲喂母乳，采用抗病毒、抗细菌药物，防止猪圆环病毒2型引发继发感染，并配合免疫球蛋白进行治疗，口服糖盐水或静脉注射10%葡萄糖盐水和3%-5%碳酸氢钠溶液，补充Vc。对于治疗无效仔猪，立即扑杀，严格的无害化处理。

2结果与分析

2.1临床症状及病理解剖结果

送检3头仔猪表现现为精神沉郁，怕冷，体型消瘦，腹泻严重，拉黄色粪便。经养殖户了解到该生猪养殖场共饲养母猪260多头，所产仔猪近期有20%左右发病，发病时间已达2个多月，发病仔猪死亡率不高，仔猪从出生的第2天发病，主要症状表现腹泻，拉黄色粪便，仔猪断奶后病情有所好转，同养殖场大猪、保育猪均表现正常。

实验室剖检3头仔猪，可见仔猪肾脏出血、肠膨气胀肿、肺出血变白、脾脏肿大，结合腹泻仔猪临床症状、及养殖场发病情况调查，初步怀疑仔猪感染病毒性疾病。

2.2PCR检测结果与分析

3头仔猪样品PCR检测结果显示（见图1）：1号猪组织样品猪圆环病毒抗原检测出现阳性条带，片段大小为701bp；1号猪、2号猪、3号猪组织样品轮状病毒抗原检测出现阳性条带，片段大小为374bp；均与预期相符，其他病毒检测结果均为为阴性；说明该生猪养殖场发生了猪圆环病毒2型和猪轮状病毒的混合感染。

2.3治疗结果

采取1.4所述治療措施7d后回访，养殖场未出现新病例，14d后回访，疫情已被控制，养殖场正常运转。

3结果讨论

临床上猪圆环病毒2型与猪轮状病毒混合感染仔猪的案例并不常见，仅根据病猪临床症状和病理变化，根本无法确诊，科学的诊断必须在此基础上进行实验室检测。RV实验室检测可以采用电镜法、放射免疫实验、ELISA双抗体夹心法和PCR病原检测等H。PCV-2实验室检测包括病毒分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫组化技术、PCR病原检测等。PCR技术具有特异性强、敏感度高、快速、简便、重复性好等突出优点，在动物疫病病原学检测中越来越受欢迎，PCR技术在不断完善与改进，临床已有成熟的PCR方法进行猪轮状病毒、猪圆环病毒2型的检测。此次实验室检测正是采用PCR技术。

根据腹泻仔猪临床症状、剖检病理变化以及实验室PCR检测结果，确诊为该养殖场发生了猪圆环病毒2型（PCV-2）与猪轮状病毒（RV）混合感染。该养殖场仔猪腹泻主要发生在哺乳仔猪，揭示母源抗体水平下降。此次腹泻由猪轮状病毒感染引发，而猪圆环病毒感染则使病情进一步恶化。

在确定病因后，养殖场立即采取对母猪、哺乳仔猪、断奶仔猪紧急免疫接种猪圆环病毒2型弱毒苗、猪轮状病病毒弱毒疫苗，对发病仔猪进行隔离治疗以及加强养殖场饲养管理等方面措施，最终控制了疫情。

4结论

该养殖场发生了猪圆环病毒2型与猪轮状病毒混合感染疫情，通过对母猪、断奶仔猪、哺乳仔猪进行疫苗免疫，以及加强养殖场饲养管理等措施，最终控制了疫情。