胡 桓 郑江红

iRGD-外泌体-阿霉素抑制成纤维细胞体外增殖的研究

胡 桓 郑江红

目的探讨应用iRGD-外泌体-阿霉素抑制成纤维细胞体外增殖的有效性及靶向性。方法体外转染iRGD，提取外泌体，通过电穿孔包裹阿霉素，利用流式细胞仪检测iRGD-外泌体-阿霉素对成纤维细胞的亲和力，并对iRGD-外泌体-阿霉素抑制成纤维细胞的增殖能力进行分析。结果iRGD-外泌体-阿霉素对成纤维细胞的亲合力高于空白转染-外泌体-阿霉素；iRGD-外泌体-阿霉素可明显抑制成纤维细胞的增殖，空白转染-外泌体-阿霉素无明显的抑制作用。结论iRGD-外泌体-阿霉素能通过靶向作用于成纤维细胞，以抑制成纤维细胞的增殖，可应用于瘢痕疙瘩的治疗研究。

外泌体阿霉素瘢痕疙瘩成纤维细胞

瘢痕疙瘩是一种具有特殊性质的病理性瘢痕，表现为成纤维细胞的异常增殖，不同个体临床表现不同，治疗效果也不尽相同。瘢痕疙瘩不但严重影响外观，导致关节及体表器官功能障碍，还可影响儿童肢体及关节的正常发育[1]。瘢痕疙瘩的病因尚不明确，单纯手术切除术后复发率高，且手术治疗相对复杂、并发症风险较高。因而，药物治疗联合手术切除或放疗，是目前治疗瘢痕疙瘩的主要方法。文献报道，外泌体为一种特异性的纳米囊泡载体，能包裹阿霉素等化疗药物，利用外泌体的特性可降低传统化疗的副作用，并显著降低药物的溶解性和循环中较短的半衰期，而通过iRGD-外泌体靶向作用于成纤维细胞上的αν整合素，可抑制成纤维细胞增殖[2]。我们根据iRGD与αν整合素特异性结合的原理[3]，体外转染iRGD与外泌体结合，经电穿孔将阿霉素包裹于外泌体中，iRGD-外泌体-阿霉素靶向结合成纤维细胞，经胞吞作用将阿霉素摄入细胞内，起到抑制成纤维细胞异常增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

成纤维细胞（3T6）、人肾上皮细胞系（293T）均购于中科院上海细胞所[4]；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM培养液、胰酶、PBS（凯基生物）；外泌体提取试剂（美国Invitrogen公司）；阿霉素（美国Sigma公司）。

电穿孔仪（美国Invitrogen公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在DMEM培养基中加入10%的小牛血清，于37℃、5%CO2培养箱中培养293T细胞，待细胞融合至85%～90%时，传代培养，收集第6～8代293T细胞用于后续实验[5]。

1.2.2 质粒构建与细胞转染

将293T细胞接种至六孔板，待细胞85%～90%融合时，按Lipofectamine 2000说明书配置溶液A：240 μL无血清DMEM+10 μL Lipofectamine2000；溶液B：233 μL无血清DMEM+17 μL pcDNA3.1（+）-hLAMP2b-Cys-iRGD质粒。质粒序列：TGCTGTAGAGGTGACAAAGGCCCAGATTGTGGTGGATCATGC。将A、B溶液在5 min内混匀，室温放置20 min后，每孔各加入2 mL DMEM，A、B混合液悬滴加入培养液中，标记为空白转染组（对照组）、iRGD转染组（实验组）。摇动培养板轻轻混匀，放置在37℃、5% CO2培养箱中培养。6 h后更换含10%胎牛血清的FBS培养液，24 h后收集上清，提取外泌体[6]。

1.2.3 外泌体的提取

细胞转染后收集上清，2 000 g离心30 min，离心后收集1 mL上清，加入500 μL Total Exosome Isolation reagent，4℃放置过夜，10 000 g 4℃离心1 h，弃上清，分别获得空白转染-外泌体（blank-exo，对照组）、iRGD-外泌体（iRGD-exo，实验组），沉淀，-20℃保存。

1.2.4 药物包装

将0.2 μL外泌体+50 μg阿霉素用buffer混匀（200 μL体系），常温下1 000 V、20 ms电穿孔后4℃保存[7]，分别获得空白转染-外泌体-阿霉素（blankexo-dox，对照组）与iRGD-外泌体-阿霉素（iRGD-exo-dox，实验组）。

1.2.5 iRGD的RT-PCR检测

取冻存外泌体抽提RNA，将其转合成为cDNA，进行PCR反应，GAPDH设为管家基因。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 sec，40℃退火40 sec，72℃延伸1 min。将EP管放入仪器扩增，循环35次；72℃延伸10 min。4℃储存。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，并检测拍照。

GAPDH引物序列：上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；iRGD引物序列：上游TCGATGTTAGACCTGGAAATAGTGGTGCTGTG，下游CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA。

1.2.63 T6细胞染色

用含10%胎牛血清的FBS培养液在37℃、5% CO2培养箱中培养两组3T6细胞，待细胞65%～70%融合时，以试剂Dio进行细胞染色。使用DMSO配置成1 mM浓度作为储存液，PBS稀释200倍至5 μM工作液，将稀释好的Dio染料悬滴加入3T6细胞培养皿中，37℃、5%CO2孵育1 h。PBS溶液清洗染剂，在细胞培养皿中加入10 mL含10%胎牛血清的FBS培养液[8]。

1.2.7 外泌体结合

将获取的blank-exo-dox、iRGD-exo-dox悬液分别悬滴加入Dio染色的3T6细胞培养皿中，37℃、5%CO2孵育1 h后，PBS清洗3次，去除多余的外泌体，分别得到A组（blank-exo-dox-3T6，实验组）、B组（iRGD-exo-dox-3T6，对照组）细胞，分别进行流式细胞仪检测和细胞增殖检测[9]。

1.2.8 流式细胞仪检测

胰酶消化后分别获取A组和B组细胞悬液，1 000 g离心3 min后弃上清，获取细胞沉淀，将两组细胞沉淀分别加入0.9%NaCl，稀释至1 mL，流式细胞仪检测[11]。

1.2.9 细胞增殖检测

取96孔板，分别用于检测A、B组细胞，每孔加入100 μL的A或B细胞悬液（104个/孔）。将培养板置于37℃、5%CO2的条件培养箱中分别孵育0、24、48、72、96 h，向待测孔加入10 μL CCK-8溶液。每组细胞、每个时间点取3个样品检测，将培养板在培养箱内孵育1～4 h[10]，酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

2 结果

2.1 iRGD-外泌体的鉴定

我们通过RT-PCR对iRGD mRNA的表达水平进行评估。结果显示，相较于blank-exo，iRGD-exo具有较高水平的iRGD mRNA表达[11]（图1）。

2.2 iRGD-外泌体-阿霉素靶向于成纤维细胞研究

为了确认iRGD是否靶向于成纤维细胞上的αν整合素，我们将blank-exo-dox、iRGD-exo-dox悬液分别悬滴加入Dio染色的3T6细胞培养皿中。流式细胞仪证实，iRGD-exo-dox与成纤维细胞的结合效率高于blank-exo-dox（分别为45.6%、9.2%），这表明以多肽为标靶的iRGD显著增强了外泌体靶向于成纤维细胞的能力[12]（图2）。

图1 RT-PCR检测iRGD的mRNA表达Fig.1 The mRNA expression of iRGD detected by RT-PCR

图2 流式细胞仪检测结果Fig.2 Results of flow cytometry

2.3 iRGD-外泌体抑制成纤维细胞的效果

使用iRGD-exo-dox与blank-exo-dox对成纤维细胞进行24、48、72、96 h存活能力分析。CCK-8检测显示，iRGD-exo-dox抑制了细胞的增殖，但在blank-exo-dox中并没有观察到明显的抑制现象，表明iRGD-exo-dox对成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用（图3）。

图3 3T6细胞增殖曲线Fig.3 The curve of cell proliferation in 3T6 cells

3 讨论

目前针对瘢痕疙瘩的治疗仍然缺乏很好的方法。现有的治疗方法包括手术、化疗药物、类固醇药物瘢痕内局部注射，以及同位素和放射治疗。化疗药物阿霉素瘢痕内注射，用药后敏感性较高，皮损消退快，但存在大剂量用药后出现类似化疗的不良反应。因此，我们参考Tian等[13]利用iRGD-外泌体包裹阿霉素靶向识别乳腺癌上的αν整合素的实验思路，设计本实验，将阿霉素包裹于iRGD-外泌体之中，并作用于高表达αν整合素的成纤维细胞，体外监测其对成纤维细胞增殖的抑制作用[9]。

阿霉素在多种肿瘤疾病的治疗中具有关键作用，但由于具有剂量毒性，所以在临床应用中受到极大限制[9]。利用自然存在的纳米级别的药物载体，转载药物来治疗肿瘤的方法，已表现出极大的应用前景[14]。我们使用转染iRGD的外泌体包裹阿霉素作用于成纤维细胞，证实转染后的外泌体具有标靶成纤维细胞的功效。实验中，iRGD-外泌体对于带有αν整合素的成纤维细胞具有很强的亲和力，并能显著抑制成纤维细胞的增殖。实验表明，外泌体似乎是一种更好地将药物传递到成纤维细胞的方法[15]。

与传统化疗方法相比，以外泌体为载体的靶向治疗优势明显。第一，外泌体可来源于患者自身细胞，相比人造的运载工具有较低的免疫原性。第二，外秘体具有磷脂双分子层，可以直接与靶细胞膜融合，而且毒性较低[16]。第三，外泌体为自然的纳米细胞，可以避免单核细胞吞噬，且易于穿透肿瘤毛细血管组织，使化疗药物易于在肿瘤内扩散。这些潜在优势使其成为治疗瘢痕疙瘩理想的药物载体[17]。

4 结论

本实验表明，iRGD-外泌体是一种天然的纳米级药物传递平台，能针对性地递送化疗药物到瘢痕疙瘩中，并能降低化疗反应，提高药物对成纤维细胞增殖的抑制作用，从而给瘢痕疙瘩的治疗带来了新的思路。

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The Inhibition of iRGD-Exosomes-Doxorubicin on the Proliferation of Fibroblasts in VitroHU Huan,ZHENG

Jianghong．Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233, China.Corresponding author:ZHENG Jianghong(E-mail:zjhsh68@sohu.com).

ObjectiveTo investigate the effect and targeting of iRGD-exosomes-doxorubicin(iRGD-exo-dox)on the inhibition of the proliferation of fibroblasts.MethodsThe exosomes were extracted from the iRGD-transfected fibroblasts. The doxorubicin was wrapped by electroporation.Flow cytometry was used to detect the affinity of iRGD-exo-dox to fibroblasts.The ability of iRGD-exo-dox on inhibiting the proliferation of fibroblasts was analyzed.ResultsThe affinity of iRGD-exo-dox to fibroblasts was higher than the blank-exo-dox.The proliferation of fibroblasts was obviously inhibited by iRGD-exo-dox.The inhibition effect was not observed in blank-exo-dox group.ConclusioniRGD-exo-dox can inhibit the proliferation of fibroblasts by targeting function,which can be used in the treatment of keloid.

Exosomes;Doxorubicin;Keloid;Fibroblasts

R619+.6

A

1673－0364（2017）02－0070－04

2016年12月19日；

2017年2月10日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.003

200233上海市上海交通大学附属第六人民医院整形外科。

郑江红（E-mail：zjhsh68@sohu.com）。