李明，姚文平，席娟

（1.南京中医药大学连云港附属医院，连云港市中医院，江苏连云港222000；2.济宁医学院附属医院，山东济宁272029）

去甲肾上腺素诱导人巨噬细胞白细胞介素6表达及其机制

李明1，姚文平1，席娟2

（1.南京中医药大学连云港附属医院，连云港市中医院，江苏连云港222000；2.济宁医学院附属医院，山东济宁272029）

目的观察去甲肾上腺素（NE）预处理人单核/巨噬细胞U937细胞白细胞介素6（IL-6）的表达，探讨其致动脉粥样硬化可能的作用机制。方法NE 0.01～10 μmol·L-1与U937细胞共培养24 h后，RT-PCR法检测细胞IL-6 mRNA水平；共培养6，9，12，24和48 h后，ELISA法检测细胞培养液上清中IL-6蛋白水平；共培养24 h后，荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）的生成。预先加入ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘（DPI）或线粒体复合物Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮（TIFA）孵育1 h后，再加入NE 0.01～10 μmol·L-1继续培养24 h，ELISA法检测细胞培养液上清中IL-6蛋白水平。结果巨噬细胞IL-6 mRNA表达和蛋白水平随NE 0.01～10 μmol·L-1浓度增加和孵育时间延长而升高，NE 1.0 μmol·L-1刺激24 h，IL-6 mRNA表达和蛋白水平分别为细胞对照组的2.62和4.47倍（P＜0.01）；NE 0.01,0.1,1.0和10.0 μmol·L-1组ROS的生成分别为对照组的1.87，2.56，2.91和5.36倍（P＜0.01）。NAC 10 mmol·L-1和DPI 10 μmol·L-1均一定程度地抑制IL-6蛋白的表达（P＜0.01），而TIFA无影响。结论NE可诱导人巨噬细胞IL-6的表达，并可能通过NADPH氧化酶介导的ROS通路而促进炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生和发展。

去甲肾上腺素；巨噬细胞；白细胞介素6；活性氧

全身炎症或血管壁的局部炎症与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）有密切联系。各种炎症特征因子在单核/巨噬细胞中被激活，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、基质金属蛋白酶9和C反应蛋白等［1-3］。然而，在这些炎症因子中，IL-6是心血管疾病发病的高危因子，它不仅是一个炎症标志物，而且直接参与了AS的形成和发展。据报道，内源性IL-6参与了生长因子诱导的成纤维细胞、血管平滑肌细胞和肾小球膜细胞增殖［4-5］。最近体外研究也显示，IL-6通过增加黏附分子、细胞因子、炎症趋化因子和增强因子直接参与致炎和致AS的作用［6］。去甲肾上腺素（norepineph⁃rine，NE）通过激活肾上腺素受体，作用于血管平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞等效应细胞。NE与血管细胞增殖和组织重塑所致的AS、高血压和心衰有关。NE作为一个潜在的致炎因子，能够诱导肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和Toll样受体4的表达［7-9］。体外研究结果表明，NE通过刺激丝裂原活化蛋白激酶磷酸化和NADPH介导的ROS合成介导细胞的增殖［9］。

尽管大量研究表明，NE和IL-6参与了心脑血管疾病的发生发展；并且笔者亦研究发现，NE能够通过ROS的介导诱导基质金属蛋白酶9的表达［10］，但未从分子水平上探讨NE对IL-6表达的诱导作用。因此，本研究探讨NE对人单核/巨噬细胞U937表达IL-6的影响，以及此过程与ROS等信号通路的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

人单核/巨噬细胞U937由美国Cascade Bio⁃logics公司提供；RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；NE、NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘（diphenyleneiodonium，DPI）、ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和线粒体复合物Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone，TIFA）均购自美国Sigma公司；PCR引物由中国北京奥科生物技术有限责任公司合成；PerfectshotTMTaq酶购自大连宝生物工程有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自美国In⁃vitrogen公司；逆转录试剂盒、DNA标准和蛋白标准均购自德国的Fermentas公司；蛋白酶抑制剂（cocktail）购自瑞士Roche公司；RIPA裂解液由北京百泰克生物技术有限公司提供；ELISA和ROS检测试剂盒来自于江苏碧云天生物技术公司。荧光显微镜为日本Olympus公司产品；垂直电泳-转膜装置及凝胶扫描成像系统（Gel DOC2000）和梯度PCR仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 细胞培养

用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养U937细胞，在37℃含5%CO2的培养箱中孵育24～48 h后，换培养液继续培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。用无血清培养基继续培养24 h后开始实验。

1.3 逆转录PCR检测细胞IL-6 mRNA水平

以NE 0.01～10 μmol·L-1分别与U937细胞培养24 h后收集细胞，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，浓度及纯度测定使用紫外分光光度计进行，取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA，取逆转录产物2 μL进行PCR循环。IL-6引物序列：上游5’-AT⁃GAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3’，下游5’-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’，扩增产物长度为629 bp。内参GAPDH引物序列：上游5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游5’-GGAA⁃GATGGTGATGGGATT-3’，扩增产物长度为205 bp。取PCR产物80 V电泳30 min，凝胶图像分析系统扫描摄图，并分析IL-6和GAPDH条带积分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以IAIL-6/IAGAPDH比值表示IL-6 mRNA相对表达水平。

1.4 ELISA测定细胞上清液IL-6蛋白含量

以NE 0.01～10 μmol·L-1分别与U937细胞培养0，6，9，12，24和48 h；或预先加入抗氧化剂NAC（10 mmol·L-1）、NADPH氧化酶抑制剂DPI（10 μmol·L-1）、线粒体复合物Ⅱ抑制剂TIFA（10 μmol·L-1）孵育细胞1 h，然后再与不同浓度的NE共孵育24 h。收集U937细胞离心后吸取上清液。依照ELISA试剂盒说明书测定IL-6蛋白水平，在450 nm波长下用酶标仪读取各孔吸光度（A450nm）值，根据标准曲线计算IL-6蛋白浓度（ng·L-1）。

1.5 荧光探针法检测细胞ROS的生成

以NE 0.01～10 μmol·L-1分别与U937细胞培养24 h，离心收集细胞，以H2DCF-DA 10 μmol·L-1吹散细胞，在6孔培养板中继续培养20 min，于无血清培养基中112×g离心洗涤3次，每次5 min，以洗去未进入细胞内的H2DCF-DA，然后在488 nm激发波长、525 nm发射波长条件下，荧光显微镜观察并拍照。每组选择5个不同视野，每个视野包含20～35个细胞。用Image-Pro Plus软件分析细胞荧光强度。ROS的生成用细胞荧光强度总和表示。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 NE对U937细胞IL-6 mRNA表达的影响

NE 0.1～10.0 μmol·L-1与U937细胞共孵育24 h，IL-6 mRNA水平与细胞对照组比较明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；其中NE 1.0 μmol·L-1时升高最明显，IL-6 mRNA水平为细胞对照组的2.62倍（图1）。

Fig.1 Effect of norepinephrine（NE）on interleukine-6（IL-6）mRNA level in U937 macrophages identified by RT-PCR.U937 cells were incubated with NE for 24 h.IA：integrated absorbance.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 NE对U937细胞IL-6蛋白表达的影响

如图2A所示，NE 0.01～10 μmol·L-1刺激U937巨噬细胞24 h，IL-6蛋白表达增高（P＜0.01），并随着NE浓度的增高有增加趋势。如图2B所示，NE 0.1 μmol·L-1刺激U937巨噬细胞6 h时，IL-6蛋白水平与细胞对照组比较明显增加（P＜0.05）；与NE 1.0 μmol·L-1共孵育0～48 h，U937巨噬细胞IL-6蛋白表达随时间增加而升高。

Fig.2 Effect of NE on IL-6 protein level in U937 macrophages assayed by ELISA.A：U937 cells were incubated with NE for 24 h；B：U937 cells were incubated with NE for 0-48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.3 NE对U937细胞ROS水平的影响

如图3所示，荧光显微镜观察显示，荧光探针H2DCF-DA标记的U937细胞对照组仅有少量ROS生成。与细胞对照组相比，NE 0.01～10 μmol·L-1显著增加U937细胞ROS水平（P＜0.01），并随浓度的增加有升高趋势。

2.4 预先加入NAC、DPI和TIFA对NE诱导U937细胞IL-6蛋白表达的影响

如图4所示，与细胞对照组相比，NE 0.01～10.0 μmol·L-1诱导U937细胞IL-6蛋白表达明显升高（P＜0.01）；预先加入抗氧化剂NAC 10 mmol·L-1，NE 0.01～10.0 μmol·L-1对IL-6蛋白表达的诱导作用明显降低（P＜0.01）。预先加入NADPH氧化酶抑制剂DPI 0.01～1.0 μmol·L-1，也可抑制NE诱导的IL-6蛋白表达（P＜0.01）。线粒体复合物Ⅱ抑制剂TIFA 10 μmol·L-1对NE诱导的IL-6蛋白表达无明显影响。上述结果表明，可能是ROS信号通路介导了NE诱导U937细胞IL-6蛋白的表达。

Fig.3 Effect of NE on reactive oxygen species（ROS）level in U937 macrophages observed under fluores⁃cence microscope.U937 cells were incubated with NE for 24 h，then incubated with H2DCF-DA 10 μmol·L-1for 30 min.FI：fluorescence intensity.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Fig.4 Effect of different inhibitors on NE-stimulated IL-6 protein expression in U937 macrophages assayed by ELISA.U937 cells were stimulated with NE for 24 h after pretreatment with antioxidant N-acetylcysteine（NAC）10 mmol·L-1，NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium（DPI）10 μmol·L-1or complexⅡinhibitor thenoyltrifluoroacetone（TIFA）10 μmol·L-1for 1 h.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group；##P＜0.01，compared with corresponding NE group.

3 讨论

IL-6作为重要的炎症因子在AS中扮演重要角色，平滑肌细胞和内皮细胞均表达该炎症介质。其次，IL-6对淋巴细胞的激活有明显的放大作用。有数据显示，NE能诱导心肌成纤维细胞产生IL-6［11］。IL-6又是导致平滑肌细胞增殖和单核细胞趋化蛋白1释放的重要因素［12］。AS斑块中单核细胞趋化蛋白1高表达是内膜单核/巨噬细胞募集和泡沫细胞形成的主因素，因此阻断NE-IL-6信号途径，将有利于阻止平滑肌细胞增殖，一定程度上延缓AS的进程。本研究发现，NE能刺激巨噬细胞产生IL-6，说明NE可能通过刺激IL-6的产生而诱导U937巨噬细胞的炎症反应。

ROS是生物体内产生的活性含氧化合物的总称，在微量条件下能调节血管功能和结构状态，过量则可引起一些细胞大分子的氧化损伤，在血管生物学中发挥着至关重要的作用［10］。本研究结果显示，NE能诱导巨噬细胞产生ROS，随NE浓度的增加ROS的产生逐渐增多。而低浓度NE诱导的IL-6蛋白表达几乎被抗氧化剂NAC完全阻断，说明NE诱导巨噬细胞IL-6表达可能是通过ROS信号通路介导。此外，NE诱导的IL-6蛋白表达在一定程度上也被NADPH氧化酶抑制剂DPI抑制。表明此过程可能涉及到NADPH氧化酶途径，此结果与文献［13］报道一致。上述结果与我们已报道的血管紧张素Ⅱ诱导单核/巨噬细胞表达C反应蛋白是通过ROS介导这一机制相一致，不同的是C反应蛋白的表达并未涉及到NADPH氧化酶途径［2］。这一差异不仅是由于表达的细胞因子不同，也提示了IL-6及ROS表达通路的特异性。

众所周知，巨噬细胞膜表面分布着较高密度的NE受体（α和β受体），NE可通过激活NE受体发挥其在AS中的致炎作用［14］。有文献报道，NE激活单核/巨噬细胞Toll样受体4的表达也是通过NE受体的介导［15］。

综上，根据本研究结果可推测，NE可能通过NE受体-ROS信号通路诱导巨噬细胞表达IL-6而产生致AS的炎症效应，为更深入地认识NE在致AS和致炎中的作用机制提供了重要的实验依据。IL-6是否还与其他炎症通路相关、是否存在通路特异性等仍需进一步探讨。

［1］Yen JH，Yang DJ，Chen MC，Hsieh YF，Sun YS， Tsay GJ.Glycine tomentella Hayata inhibits IL-1β and IL-6 production，inhibits MMP-9 activity，and enhances RAW264.7 macrophage clearance of apoptotic cells［J］.J Biomed Sci，2010，17（1）：83.

［2］Li M，Liu J，Han C，Wang B，Pang X，Mao J. AngiotensinⅡinduces the expression of C-reactive protein via MAPK-dependent signal pathway in U937 macrophages［J］.Cell Physiol Biochem，2011，27（1）：63-70.

［3］Ge H，Zhang JF，Guo BS，He B，Wang BY，Wang CQ.Resveratrol inhibits expression of EMMPRIN from macrophages［J］.Acta Pharm Sin（药学学报），2006，41（7）：625-630.

［4］Roth M，Nauck M，Tamm M，Perruchoud AP，Ziesche R，Block LH.Intracellular interleukin 6 mediates platelet-derived growth factor-induced prolif⁃eration of nontransformed cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（5）：1312-1316.

［5］Mihara M，Moriya Y，Kishimoto T，Ohsugi Y.Inter⁃leukin-6（IL-6）induces the proliferation of synovial fibroblastic cells in the presence of soluble IL-6 receptor［J］.Br J Rheumatol，1995，34（4）：321-325.

［6］Peng N，Liu JT，Guo F，Li R.Epigallocatechin-3-gallate inhibits interleukin-6-and angiotensinⅡ-induced production of C-reactive protein in vascular smooth muscle cells［J］.Life Sci，2010，86（11-12）：410-415.

［7］Fu YC，Chi CS，Yin SC，Hwang B，Chiu YT，Hsu SL.Norepinephrine induces apoptosis in neo⁃natal rat cardiomyocytes through a reactive oxygen species-TNF alpha-caspase signaling pathway［J］. Cardiovasc Res，2004，62（3）：558-567.

［8］Yang EV，Sood AK，Chen M，Li Y，Eubank TD，Marsh CB，et al.Norepinephrine up-regulates the expression of vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase（MMP）-2，and MMP-9 in nasopharyngeal carcinoma tumor cells［J］.Cancer Res，2006，66（21）：10357-10364.

［9］Fu YC，Yin SC，Chi CS，Hwang B，Hsu SL. Norepinephrine induces apoptosis in neonatal rat endothelial cells via a ROS-dependent JNK activation pathway［J］.Apoptosis，2006，11（11）：2053-2063.

［10］Li M，Sun SB，Zhou Y，Pang XM，Xi J，Jin TY，et al.Norepinephrine induces expression of matrix metalloproteinase-9 in human macrophages and its mechanisms［J］.J Third Mil Med Univ（第三军医大学学报），2012，34（17）：1758-1761.

［11］Leicht M，Briest W，Zimmer HG.Regulation of norepinephrine-induced proliferation in cardiacfibroblasts by interleukin-6 and p42/p44 mitogen activated protein kinase［J］.Mol Cell Biochem，2003，243（1-2）：65-72.

［12］Ji YY，Wang ZD，Liu JT，Liu N.AngiotensinⅡinduces Toll-like receptor 4 expression and myelo⁃peroxidase activity in RAW264.7 cells［J］.Chin J Cell Mol Immunol（细胞与分子免疫学杂志），2008，24（11）：1037-1039，1043.

［13］Carluccio MA，Scoditti E，Massaro M，et al.The antioxidant hydroxytyrosol suppresses MMP-9 ac⁃tivity and expression in human monocytes through PKC alpha/beta 1 and NADPH oxidase inhibition-a mechanism for plaque stabilization by an olive oil component of mediterranean diets［J］.Journal of Nutrigenet Nutrigenomics，2010，3（2/3）：85-86.

［14］Li M，Yao W，Li S，Xi J.Norepinephrine induces the expression of interleukin-6 via β-adrenoreceptor-NAD（P）H oxidase system-NF-κB dependent signal pathway in U937 macrophages［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，460（4）：1029-1034.

［15］Chen J，Huang L，Wu Q.Receptor pathways involved in norepinephrine-induced intracellular ROS production in cardiac myocytes［J］.J Third Mil Med Univ（第三军医大学学报），2004，26（8）：694-696.

Norepinephrine induced expression of interleukin-6 in human macrophages and mechanisms

LI Ming1,YAO Wen-ping1,XI Juan2
(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Lianyungang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222000,China;2.Affiliated Hospital of Jining Medical College,Jining 272029,China)

OBJECTIVETo investigate the effect of norepinephrine(NE)on expression of interleu⁃kin-6(IL-6)in human macrophages and explore its pro-inflammatory and pro-atherosclerotic mecha⁃nisms.METHODSMurine U937 macrophages were cultured and stimulated with 0.01-10 μmol·L-1of NE for 6,9,12,24 and 48 h.The IL-6 mRNA level of 24 h was analyzed by RT-PCR,and IL-6 protein expression in the supernatant at 0,6,9,12,24 and 48 h was detected by ELISA.After 24 h,intracellular reactive oxygen species(ROS)generation was observed by DCF fluorescence.The cells were pretreated with antioxidant N-acetylcysteine(NAC),complexⅡinhibitor thenoyltrifluoroacetone(TIFA)and NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium(DPI)for 1 h,and stimulated with different concentrations of NE for 24 h,before the level of IL-6 protein was detected by ELISA.RESULTSThe expression of IL-6 mRNA and protein increased with the concentration NE 0.01-10 μmol·L-1and incubation time.IL-6 mRNA and protein levels in macrophages were 2.62 and 4.47-fold those in cell control group when treated with NE 1.0 μmol·L-1for 24 h.Meanwhile,as the concentration of NE increased,the generation of ROS was 1.87,2.56,2.91 and 5.36-fold that of cell control group(P＜0.01).NAC 10 mmol·L-1and DPI 10 μmol·L-1significantly antagonized the effect of NE on IL-6 expression,but TIFA had no effect.CONCLUSIONNE upregulates IL-6 expression,which may contribute to the formation and develop⁃ment of atherosclerosis via ROS mediated by NADPH oxidase in macrophages.

norepinephrine;macrophages;interleukin-6;reactive oxygen species

LI Ming,E-mail:liminglm1985@163.com，Tel:18061393860

R972

：A

：1000-3002-（2017）03-0250-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.008

Foundation item:The project supported by Pharmaceuticals Foundation of Osaikang Hospital of Jiangsu Province (201517);Science and Technology Development Plan of Lianyungang City(ZD1508);and Jiangsu Province Youth Medi⁃cal Talent Fund(QNRC2016507)

2016-03-25接受日期：2017-02-27）

（本文编辑：齐春会）

江苏省药学会-奥赛康医院药学基金（201517）；连云港市科技发展计划（ZD1508）；江苏省青年医学人才（QN⁃RC2016507）

李明，硕士，主管药师，主要从事心脑血管药理学研究。

李明，E-mail：liminglm1985@163.com，Tel：18061393860