张玉睿

(泰山医学院附属医院 感染科， 山东 泰安 271000)

microRNA-520a与HBV相关肝细胞癌临床病理学特征的相关性分析

张玉睿

(泰山医学院附属医院 感染科， 山东 泰安 271000)

目的 旨在评估microRNA-520a与肝细胞癌(HCC)患者临床病理参数之间的关系。方法 收集2010年1月-2015年12月于泰山医学院附属医院行手术治疗的183例HCC患者病例资料及组织标本。定量Real-time PCR检测microRNA-520a在纳入患者的HCC组织及其对应的癌旁组织中的表达水平，并分析其表达水平与HCC患者的临床病理特征之间的关系。多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。结果 microRNA-520a在HCC组织中的表达水平，与其对应相邻的癌旁组织相比显著降低(1.92±0.76 vs 2.73±1.15，t=-6.731，P<0.001)。受试者工作特征曲线下面积为0.711 (95%可信区间：0.64～0.79，P<0.001)。存在远期转移 (P=0.031)、高临床TNM分期(P=0.022)、血清HBV阳性(P<0.001)、存在肿瘤分隔 (P=0.026)的患者，其HCC组织中microRNA-520a的表达水平显著降低。相关因素分析表明，microRNA-520a的表达水平与HBV感染 (r=-0.351，P<0.001)以及是否存在肿瘤分隔(r=-0.207，P=0.044)呈负相关。结论 microRNA-520a在HCC组织中的表达显著下调，其可能抑制HCC进展。

癌, 肝细胞； 微RNAs； 病理状态, 体征和症状

肝细胞癌(HCC)在世界范围内最常见肿瘤中排名第5位，居肿瘤相关死因的第3位[1]。迄今为止，多达50%的新诊断HCC病例是由于HBV感染所致[2-4]。定期体检、针对高危人群定期监测均可通过常规筛查进行，而有效的早期检测和诊断有助于提高患者生存期并改善预后。腹部超声或结合血清AFP水平检测在HCC诊断方面得到了广泛认可，但是这两种技术的诊断准确性仍然非常有限[5-7]。因此，探寻有效、简便、快捷、高效而准确的可替代的循环或组织学指标来预测或诊断HCC的需求十分迫切[8-9]。目前，尽管诸多研究者已经在多种人类肿瘤中探讨了microRNA-520的作用机制[10-13]，但是仍然未见有关microRNA-520a在HCC中的作用及机制的相关报道。本文旨在探讨microRNA-520a与HCC患者临床病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2010年1月-2015年12月于本院行手术治疗的HCC患者病例资料及组织标本。所有患者诊断明确并且均为第一次接受肝切除手术治疗。本研究经本院医学研究伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。病理诊断由两位相对独立的有多年临床病理诊断经验的病理学专家完成。

1.2 组织标本的处理 收集的组织标本包括手术切除的HCC组织及其对应的相邻癌旁肝组织。上述标本先经福尔马林处理，然后采取石蜡包埋。

1.3 总RNA提取及定量Real-time PCR检测 应用瑞典Qiagen公司生产的miRNeasy FFPE 试剂盒(AB73504)从福尔马林固定石蜡包埋的HCC组织及癌旁组织中提取总RNA。采用分光光度计检测所提取到RNA的光密度(OD)值以鉴定RNA质量，肿瘤标本OD260/280的分光光度值为1.82～2.08，癌旁组织的OD260/280的分光光度值为1.92～2.03，提示所提RNA质量较为理想。

进一步采取定量Real-time PCR检测HCC组织及癌旁组织中microRNA-520a的表达水平。为避免基因组DNA的污染及影响，首先采取如下措施消除基因组DNA：(1)配制混合物，即5 × gDNA Eraser缓冲液2.0 μl，1.0 μl gDNA Eraser，然后加入微量总RNA后用RNase-free H2O补充至总量10.0 μl。(2)将前述混合物保持在42 ℃ 2 min，然后在4 ℃保存待用。(3)应用美国Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司的TaqMan microRNA逆转录试剂盒(4366596)将总RNA逆转录为cDNA，试剂体系为总量20.0 μl，其中包括上述去除基因组DNA的10.0 μl体系，另外再加入4.0 μl 5×PrimeScript缓冲液，1.0 μl PrimeScript RTEnzyme混合物Ⅰ，以及1.0 μl 引物混合物，最后加入4.0 μl RNase-free H2O。(4)采取定量Real-time PCR方法使用PCR7900热循环仪(Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司)检测microRNA水平。各检测模板的目标序列见表1。

PCR反应体系总体积为20.0 μl，其中包括10.0 μl LightCycler 480 SYBR Green I混合物(德国，罗氏公司)，0.8 μl 正向PCR引物(10 μmol/L)，0.8 μl反向PCR引物(10 μmol/L)，1.0 μl cDNA模板(<100 ng)和7.4 μl RNase-free H2O。应用LightCycler 480(德国，罗氏公司)执行定量Real-time PCR检测，反应条件如下：在95 ℃下预变性5 min；95 ℃ 12 s，60 ℃ 8 s、72 ℃ 15 s为1个循环，共40个循环；溶解度曲线分析为95 ℃ 5 s、65 ℃ 60 s；最后在40 ℃下冷却30 s。每个反应进行6次。相对mRNA表达水平microRNA-520a计算使用2-ΔΔCt方法。

表1 各检测模板的目标序列

注：选择RNU6B和RNU48作为内参照以进行试验的质量控制

2 结果

2.1 一般资料 共入组183例患者资料，其中男148例，女35例。平均58岁(23～78岁)，平均肿瘤大小5.4 cm(1～12.3 cm)。患者临床及病理学特征见表2。

2.2 microRNA-520a的表达水平在HCC组织中显著下降 通过运用RNU6B和RNU48的表达水平进行标准化后，结果提示microRNA-520a的表达水平在HCC组织中与对应的癌旁组织相比明显减少(1.92±0.76 vs 2.73±1.15，P<0.001)(表2，图1)。ROC曲线下面积(AUC)用于区分肿瘤和非肿瘤组织，AUC=0.711 (95%可信区间:0.64～0.79，P<0.001) (图2)，最佳cut-off值为2.25。该结果也明确表明microRNA-520a在肝细胞癌中的表达显著下调。

2.3 microRNA-520a的表达水平与HCC患者临床病理特点之间的差异分析 microRNA-520a的表达水平在出现远期转移患者的HCC组织中显著降低(P=0.031)。此外，患者存在如下因素时microRNA-520a的表达水平也显著降低，包括高临床TNM分期(P=0.022)、血清HBV阳性(P<0.001)、存在肿瘤分隔 (P=0.026) (表2)。

表1 HCC患者组织中microRNA-520a表达水平与临床病理特征的关系

注：VEGF，血管内皮生长因子；MVD，微血管密度

图1 HCC组织及对应癌旁组织定量Real-time PCR检测microRNA-520a表达水平

图2 区分肿瘤和非肿瘤组织的ROC曲线AUC,ROC曲线下面积

但是，在如下因素中未发现microRNA-520a的表达水平存在显著差异，这些因素包括年龄、性别、组织学分化程度、肿瘤大小、肿瘤数量、门静脉肿瘤栓子、HCV感染、AFP水平、肝硬化、P53、P21、VEGF以及MVD(表2)。

2.4 microRNA-520a的表达水平与HCC患者临床病理特点之间的相关性分析 Spearman相关分析结果显示microRNA-520a的表达水平与HBV感染(r=-0.351，P<0.001)以及是否存在肿瘤分隔(r=-0.207，P=0.044)呈负相关。

3 讨论

Keklikoglou等[11]发现microRNA-520/373家族对乳腺癌具有抑制肿瘤的效果，它是联系TGFβ和核因子-κB通路之间的重要因素，可能导致交互炎症、影响肿瘤转移或进展过程。研究[12]发现，microRNA-520-3p通过靶向MAP3K2，抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和转移，临床上microRNA-520-3p可以作为非小细胞肺癌的预后标志物。Mazan-Mamczarz等[13]证明过表达microRNA-520c-3p可抑制细胞增殖及其全部基因的表达，从而促进DLBCL细胞的未成熟衰老过程。该研究发现，过表达miR-520c-3p抑制人类异种移植瘤在小鼠模型体内的生长过程 。

HCC的发生是一个多因素参与、多步骤的复杂过程，与HBV慢性持续感染密切相关[14]。HBV慢性感染引起肝脏炎症损伤、继发性肝纤维化、肝细胞再生及增殖等，最终导致肝脏恶性转化[15]。大多数HCC患者死于肿瘤快速进展相关的病程，早期诊断HCC时仅有肝切除或肝移植是有效可行的可治愈方法[16]。但是更为有效的诊断方法及其治疗靶点尚不明确。已有研究[17]证实，microRNA在调节基本细胞过程中起着关键性作用，这些过程包括发育、增殖、细胞命运选择及凋亡，几乎60%的人类基因受microRNA调控。microRNA可以调控多种类型的肿瘤，其异常表达与某些肿瘤的发生密切相关[18]，其作用机制在于microRNA异常表达时通过下调肿瘤抑制基因或癌基因的表达而促进或抑制肿瘤发生过程[19-22]。

本研究检测了183例HBV相关HCC患者的HCC组织及对应癌旁组织中microRNA-520a的表达水平，并分析了其表达水平与患者病情及临床病理特征之间的相关性。结果提示，microRNA-520a在HCC组织中的表达显著下调。而且，其表达水平与患者的远期转移、临床TNM分期、HBV阳性及肿瘤分隔相关，即在远期转移、和(或)高TNM分期、和(或)HBV阳性、和(或)存在肿瘤分隔的患者中其表达水平更低。这就明确提示，microRNA-520a的表达水平下降可能与患者的不良病情及预后相关。microRNA-520a的最佳cut-off值为2.25，假阳性和假阴性率分别为0.23和0.56。因此，笔者推测microRNA-520a有可能作为组合性microRNA评估指标之一，用于HCC患者的病情及预后评估。其在HCC中的作用机制目前未见报道，有待进一步地深入研究。microRNA-520a也可能成为治疗HCC的新靶点，通过调控microRNA-520a的表达水平以干预HCC患者的病情进展及改善预后。

本课题组首次通过一定样本量的实验研究了microRNA-520a在HCC患者病理组织标本中表达水平，并证实其与HCC患者病情及预后相关，可能具有一定的临床意义。但是，本研究仍存在一定的局限性，如实验样本为单中心、样本量受限等。此外，在细胞水平及动物实验中的研究仍在进行，包括HBV相关HCC患者的血清学检测研究也仍需完善。

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(本文编辑：王 莹)

Correlation between microRNA-520a and clinicopathological features of HBV-related hepatocellular carcinoma

ZHANGYurui.

(DepartmentofInfectiousDiseases,TheAffiliatedHospitalofTaishanMedicalCollege,Tai′an,Shandong271000,China)

Objective To investigate the correlation between microRNA-520a and clinicopathological parameters in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The medical records and tissue specimens of 183 HCC patients, who received surgical treatment in the Affiliated Hospital of Taishan Medical College from January 2010 to December 2015, were collected. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of microRNA-520a in HCC tissues and corresponding adjacent tissues from 183 patients with HCC, and its correlation with clinicopathological parameters was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the independent samplest-test was used for comparison between two groups; Spearman correlation analysis was also performed. Results HCC tissues had significantly lower expression of microRNA-520a than corresponding adjacent tissues (1.92±0.76 vs 2.73±1.15,t=-6.731,P<0.001). The area under the receiver operating characteristic (ROC) curve was 0.711 (95%CI:0.64-0.79,P<0.001). There were significant reductions in the expression of microRNA-520a in HCC tissues in patients with distant metastasis (P=0.031), advanced TNM stage (P=0.022), positive serum hepatitis B virus (HBV) (P<0.001), or tumor separation (P=0.026). The Spearman correlation analysis showed that the expression of microRNA-520a was significantly correlated with HBV infection (r=-0.351,P<0.001) and tumor separation (r=-0.207,P=0.044). Conclusion The expression of microRNA-520a is significantly downregulated in HCC tissues and it may inhibit the progression of HCC.

carcinoma, hepatocellular; microRNAs; pathological conditions, signs and symptoms

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.04.018

2016-10-31；

2016-11-22。

张玉睿(1981-)，女，主治医师，主要从事病毒性肝炎及肝癌的基础与临床研究。

R735.7

A

1001-5256(2017)04-0689-05