杨 蕾 王继峰 牛建昭 赵丕文 孙丽萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悦 齐明月

(北京中医药大学，北京，100029)

二仙汤含药血清对顺铂干预的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白bcl-2、bax表达的影响

杨 蕾 王继峰 牛建昭 赵丕文 孙丽萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悦 齐明月

(北京中医药大学，北京，100029)

目的：观察二仙汤含药血清对顺铂干预的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白bcl-2、bax表达的影响，从细胞凋亡的角度探讨二仙汤含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。方法：22～24 d的SD雌性大鼠30只，随机分为3组，分别为生理盐水组，补佳乐组，二仙汤组。每组大鼠10只。给药4 d后处死大鼠，心脏取血，制备药物血清。22～24 d的SD大鼠卵巢颗粒细胞，经培养贴壁后，用顺铂损伤大鼠原代卵巢颗粒细胞。经各组药理血清作用后，应用放免法，进行雌激素和孕激素水平测定及分析。应用免疫组化法，测定各分组bcl-2、bax蛋白的表达情况，并进行图像分析。结果：放免结果显示，与正常组相比，模型组和补佳乐组E2表达明显改变，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，补佳乐组、二仙汤组E2表达均有增加；与正常组相比，模型组P表达水平有所变化，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，二仙汤组P表达略高于补佳乐组，但低于正常组。免疫组化结果显示，在卵巢颗粒细胞细胞质上可见bcl-2和bax蛋白表达的棕黄色颗粒。和正常组相比较，顺铂干预后各组bcl-2表达均减弱，而以模型组最明显，有统计学意义(P<0.05)；和模型组比较，各药物组均可见bcl-2阳性表达增加，但弱于正常组，有统计学意义(P<0.05)。bax与bcl-2表达强度结果相反，和正常组比较，顺铂干预后的各组bax均表达增强，模型组呈现极强表达现象，有统计学意义(P<0.05)；和模型组比较，各药物组均可见阳性表达减弱，但表达高于正常组，有统计学意义(P<0.05)。结论:二仙汤能降低经顺铂干预后大鼠bax蛋白在卵泡颗粒细胞表达，增强bcl-2蛋白的表达，二仙汤能够通过调节凋亡蛋白bcl-2、bax蛋白的表达，抑制卵巢颗粒细胞发生凋亡，从而保护卵巢功能。

二仙汤；顺铂；颗粒细胞；细胞凋亡

卵巢颗粒细胞对育龄期女性的生殖功能起着重要的作用。正常卵泡生长、发育以及排卵均需要颗粒细胞的正常的增殖和功能表达[1]。顺铂作为抗癌药物，在临床治疗肿瘤的同时也具有细胞毒性作用。它可以破坏正常的卵巢颗粒细胞，使其发生凋亡，甚至形成卵巢早衰[2]。而传统医学认为卵巢功能发生异常主要是肾气亏虚，精血不足所致，治当以填精益髓，调理阴阳，补益天癸。二仙汤是张伯讷教授研制出来的以补肾为主的方剂。在临床治疗卵巢功能异常中具有明显的疗效。

本实验观察二仙汤含药血清对顺铂干预的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白bcl-2、bax表达的影响，旨在从细胞凋亡的角度探讨二仙汤含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 22～24 d健康雌性SD大鼠，共40只，体质量(60±10)g。购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司。使用许可证：SCXK(京)2011-0004。

1.1.2 药物 二仙汤由淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、黄柏和知母组成。按照《妇科临床方剂学》规定的剂量比(9∶6∶10∶15∶12∶10)称取，由北京中医药大学东直门医院提供,根据东直门院提供的中药颗粒与中药饮片的固有比例进行计算，最终按照人用药剂量计算大鼠用药剂量为7.5 mg/(kg·d)。注射用顺铂(CDDP)，每支10 mg，由齐鲁制药有限公司生产。补佳乐(雌激素)购自东直门医院，规格：1 mg/片，由拜耳医药有～限公司生产。用法与剂量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需剂量即0.009 mg/kg。

1.1.3 试剂 免疫组化试剂：1)Bax(Rabbit polyclonal IgG)、Bcl-2(Rabbit polyclonal IgG)购于北京欧北科技有限公司。2)DAB显色剂、二抗SP-9000,(羊抗兔)购于北京中山金桥生物技术有限公司。

放免试剂：1)血清孕酮放免测定盒P(HY-031)RIAKIT、血清雌二醇放免测定盒E2-17β(HY-10029)RIAKIT均购于北京华英生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制备卵巢颗粒细胞 22～24 d雌性SD大鼠10只，体质量35 g，饲养在23～25 ℃，光照12 h，食水随意，适应性喂养1 d，注射PMSG 50IU/只，48 h后，在无菌条件下取出双侧卵巢颗粒细胞进行培养。具体操作如下：1)取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，经脱臼处死，浸泡75%乙醇中消毒3 min。2)消毒后放入已消毒托盘中在超净台中取双侧卵巢，放入预冷的Hank′s液2.7 mL。3)用Hank′s液清洗3次，将其中的脂肪、包膜等清理干净。4)将卵巢移入无血清培养基中，用1 mL一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使颗粒细胞充分释放。5)加入0.3 mL 2.5%胰酶反复用吸管吹打悬液数次，使颗粒细胞团块分离。37 ℃消化10 min(每3 min，震荡或吹打一次)。6)加入1 mL含血清培养液终止胰酶消化，并静置10 min。取悬液加入15 mL离心管中。7)1 000 r/min离心10 min，弃上清。加入生理盐水5 mL冲散细胞再次离心。8)弃上清，加入10%胎牛血清0.2 mL，吹打均匀。9)计数：应用血球小板计数，调整悬液浓度，以5×105接种于96孔板中。在37 ℃，5%CO2培养箱中培养。观察贴壁情况，待细胞长满瓶底至75%～80%融合时，用于实验。

1.2.2 制备药理血清组 22～24 d的雌性SD大鼠50只，体质量35～40 g，饲养在23～25 ℃，光照12 h，食水随意，适应性喂养1 d，第2天取药理血清。具体操作如下。药理血清动物分3组：1)正常组：灌胃蒸馏水0.4 mL/d。2)补佳乐组：灌胃补佳乐0.5 mL/d。3)二仙汤组：灌胃二仙汤0.4 mL/d，各组连续灌胃3 d，于第4天晨起七点灌胃，2 h以后，心脏取血并分离血清，-20 ℃保存。

1.2.3 顺铂干预卵巢颗粒细胞 待细胞生长至底壁的75%～80%时，将模型组、补佳乐组、二仙汤组的培养基吸出，每孔加入CDDP(浓度为2.5 μg/mL)200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培养箱中培养12 h。

1.2.4 药理血清处理 于CDDP作用12 h后，进行给药处理，每孔加入相应的药理血清组200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，进行指标测定。

1.2.5 卵巢颗粒细胞bcl-2、bax免疫组化染色步骤 免疫组化染色采用SABC法,其中bcl-2、bax的一抗浓度均为1∶200。1)96孔板每孔滴加20 μL 4%多聚甲醛固定20 min。2)1*PBS清洗标本3次，2 min/次。3)每孔滴加20 μL 0.5%tritox-100，摇匀，孵育20 min。4)1*PBS清洗标本3次，2 min/次。5)3%H2O2去离子水孵育7 min。6)1*PBS清洗标本3次，3 min/次。7)滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温孵育12 min，倾去，勿洗。8)滴加一抗，37 ℃孵育3 h。9)1*PBS清洗标本3次，3 min/次。10)滴加试剂B(生物素化二抗工作液IgG/Bio)，室温孵育12 min。11)1*PBS清洗标本3次，3 min/次。12)滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液S-A/HRP)，室温孵育12 min。13)1*PBS清洗标本3次，3 min/次。14)DAB显色剂显色。15)自来水冲洗，显微镜观察。

每孔随机选取6个视野，统一放大倍数为200倍，利用免疫组化软件包对卵巢颗粒细胞进行灰度测量分析，并测算视野内阳性目标总面积，并与视野面积相比得到阳性反应颗粒的灰度值。

1.2.6 放免法对E2及P的测定 取标本100 μL、标准品100 μL，加E2及P抗体100 μL，加E2及P标记物100 μL，37 ℃2 h，加二抗分离剂1 mL，室温15 min，3 500 r/min离心15 min。去上清，测沉淀CPM。自动放免分析仪出结果。

2 结果

2.1 各组大鼠雌二醇及孕激素实验分析结果 与正常组相比，模型组和补佳乐组E2表达明显改变，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，补佳乐组E2表达明显增加，而二仙汤组无统计学意义，但可看出与模型组相比较二仙汤组表达明显增加，见图1；与正常组相比，模型组P表达水平有所变化，有统计学意义(P<0.05)，可见模型组P表达明显减少，见图2。与模型组相比，补佳乐组、二仙汤组均有所变化，有统计学意义(P<0.05)，其中二仙汤组P表达略高于补佳乐组。可看出二仙汤含药血清能促进顺铂干预后的卵巢颗粒细胞E2和P的合成与分泌能力。见表1。

表1 各组大鼠卵巢颗粒细胞中E2、P的表达情况

注：与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图1 各组大鼠卵巢颗粒细胞中E2分泌柱状图

图2 各组大鼠卵巢颗粒细胞中P分泌柱状图

2.2 卵巢颗粒细胞中bcl-2、bax蛋白表达比较 免疫组化结果显示：各组bcl-2棕黄色阳性表达位于胞质内，其中正常组表达最多，呈深棕色；模型组bcl-2阳性细胞表达明显减少，呈淡棕色。补佳乐组、二仙汤组阳性细胞着色增强，而二仙汤组阳性表达最为明显，但少于正常组。见图3。而bax蛋白表达呈现相反的趋势，各组bax在细胞质内均有表达，可见棕黄色阳性物质位于胞质内，正常组bax阳性细胞染色较浅，呈棕色或浅棕色，表达较少。模型组阳性细胞着色较深，呈深棕色，表达较多。补佳乐组、二仙汤组和模型组相比，阳性表达细胞着色变浅，但不及正常组。见图4。

图3 检测各组大鼠卵巢颗粒细胞中bcl-2蛋白的表达情况(免疫组化×200)

注：正常组：阳性颗粒表达多，染色呈深棕色；模型组：阳性颗粒表达明显减少，呈现淡棕色；补佳乐组：阳性表达较模型组明显增多但不及正常组，呈现浅棕色；二仙汤组：阳性表达比补佳乐组表达多但不及正常组，呈现浅棕色偶有深棕色。

图4 检测各组大鼠卵巢颗粒细胞中bax蛋白的表达情况(免疫组化×200)

注：正常组：阳性颗粒表达少，染色呈浅棕色；模型组：阳性颗粒表达明显增多，呈现深棕色；补佳乐组：阳性表达较模型组明显减少但不及正常组，呈现浅棕色；二仙汤组：阳性表达比补佳乐组表达少但不及正常组，呈现浅棕色。

2.3 各组卵巢颗粒细bcl-2、bax表达的比较 免疫组化实验结果：和正常组相比较，顺铂干预后各组bcl-2表达均减弱，而以模型组最明显，有统计学意义(P<0.05)；和模型组比较，各药物组均可见bcl-2阳性表达增加，但弱于正常组，其中二仙汤组阳性表达要高于补佳乐组，有统计学意义(P<0.05)(见表2)。bax与bcl-2表达强度结果相反，和正常组比较，顺铂干预后的各组bax均表达增强，模型组呈现极强表达现象，有统计学意义(P<0.05)；和模型组比较，各治疗组均可见阳性表达减弱，但表达高于正常组，其中二仙汤组阳性表达略低于补佳乐组，有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠卵巢细胞中bcl-2、bax蛋白免疫组化图像分析结果±s，n=6)

注：与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

细胞凋亡是一个受严格调控的能量依赖性的自杀程序，它引发细胞内一系列信号级联式放大反应，最终导致细胞死亡。细胞凋亡是通过2个信号转导途径实现：一种是内在途径另一种是外在途径[3]。近年来研究表明，bcl-2蛋白广泛的存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但其主要存在于线粒体外膜，bcl-2蛋白能够促进颗粒细胞的分裂，可以抑制凋亡，近而使卵泡闭锁率降低也就是说bcl-2蛋白表达缺失，会导致卵巢组织中有效卵泡减少，严重者会出现无卵母细胞的卵泡[4]而bax蛋白约21%与bcl-2同源且有拮抗作用。高表达bax蛋白是卵子细胞死亡的关键因素，同时，bax的基因产物能加速细胞凋亡[5]。bcl-2与Bax,组成一个平衡体系，bax过度表达可以加速细胞凋亡，而bcl-2过度表达则使细胞凋亡得到抑制。免疫组化结果提示：bcl-2和bax蛋白表达与卵巢颗粒细胞凋亡密切相关，而细胞凋亡则是通过促进或抑制参与细胞凋亡的相关基因蛋白的表达情况来实现的[6]。实验结果表明二仙汤可增加bcl-2蛋白的表达进而抑制颗粒细胞的凋亡。同时，二仙汤也可以降低bax蛋白的表达进而减缓颗粒细胞的凋亡。

雌二醇(Estradiol,E2)是女性激素中生物活性最强的一种甾体类化合物，主要由卵巢合成和分泌，少量由肾上腺分泌。雌二醇浓度是检查下视丘—垂体—生殖腺轴功能的指标之一[7]。孕酮(Progesterone,P)是一种重要性激素，不仅在月经周期的调节中起重要作用，也是维持妊娠所必须的重要激素之一，P由卵巢分泌，在卵巢内主要是由黄体产生，因此，临床上测定血清孕酮的含量，对于妇女卵巢排卵功能也有着重要的意义。本实验所反映出来的激素水平，可能预示着正常卵泡由正常到功能衰竭之间的一个过渡阶段。E2的升高可作为早期卵巢功能不全或障碍的重要指标，可估计卵泡池中所剩卵泡的数量。本次实验表明，二仙汤能够升高P、E2水平，进而改善卵巢功能。

二仙汤对顺铂损伤的卵巢颗粒细胞具有较好的疗效。以往研究表明，二仙汤可以作用于垂体，改善GTH细胞的结构促性腺激素的合成和分泌，有效的治疗绝经后高血压。可以调节自身性腺分泌，使性激素增加，临床治疗月经不调。也可以延缓老年大鼠弓状核退化，用于治疗女性更年期综合征[8-11]。本次实验研究表明，二仙汤通过调节血清中激素含量，能降低顺铂干预后大鼠卵巢颗粒细胞中bax蛋白在卵泡颗粒细胞表达，增强bcl-2蛋白的表达，二仙汤可抑制卵巢颗粒细胞凋亡，降低顺铂对卵巢颗粒细胞的损害，从而促进卵泡发育，改善卵巢功能。

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(2016-06-28收稿 责任编辑：白桦)

Effects of Erxian Decoction Serum on Regulating Expression of Protein bcl-2 and bax in Rat Ovarian Granulosa Cells Apoptosis Induced by Cisplatin

Yang Lei,Wang Jifeng,Niu Jianzhao,Zhao Piwen,Sun Liping,Tao Shiying,Wu Hongbo,Cai Xinyue,Qi Mingyue

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of serum containing Erxian decoction on regulating the expression of bcl-2and bax protein from rats′ ovarian granulosa cells induced by cisplatin and to investigate the mechanism of Erxian Decoction serum on apoptosis of ovarian granulosa cells from the perspective of apoptosise. Methods:Thirty SD female rats for 22 to 24 days birth were randomly divided into three groups：the normal saline group,progynova group and the Erxian Decoction group with 10 rats in each group. After 4-day drug administration,rat hearts were taken to prepare drug serum. Ovarian granulosa cells were taken from SD rats and cultured to acquire adherent cells. Then,primary ovarian granulosa cells in rats were induced by cisplatin. After pharmacological action to serum,radio immunity method was used to detect estrogen and progestin and make analysis. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of bcl-2 and bax protein in each group and then for image analysis. Results:Test results showed that E2 expression significantly changed in the model group and progynova group (P<0.05) with statistically significant difference,compared with the normal group. Compared with the model group,the expression of E2 increased significantly in the progynova group and the Erxian Decoction group. Compared with the normal group,P expression in the model group was somewhat changed (P<0.05),which showing statistically significant difference. Compared with the model group,P expression in Erxian Decoction group was slightly higher than that of the progynova group,but lower than that of the normal group. Immunohistochemistry results showed that brown granules of bcl-2 and bax protein were expressed in the cytoplasm of ovarian granulosa cells. Compared with the normal group,the expression of bcl-2 in each group under the intervention of cisplatin was decreased,and the model group was the most obvious (P<0.05).Compared with model group,the positive expression of bcl-2 in each drug group was increased,but it was weaker than that in the normal group (P<0.05). The intensity of bax and bcl-2′s expression was opposite. Compared with the normal group,Bax expression in each group under the intervention of cisplatin were enhanced and that in the model group especially showed a strong expression (P<0.05). Compared with the model group,the positive expression of the drug groups was decreased,but was higher than that of the normal group (P<0.05) with statistically significant difference. Conclusion:Erxian Decoction can decrease the expression of Bax protein in follicular granulosa cells induced by cisplatin injury and increase the expression of bcl-2 protein. It can inhibit the apoptosis of ovarian granulosa cells and protect the ovarian function by adjusting the expression of bcl-2 and bax.

Erxian Decoction; Cisplatin; Granulosa cells; Apoptosis

教育部国家外专局创新引智基地项目(编号：B07007)；国家自然科学基金项目(编号：81273887；30772849)

杨蕾(1990.02—)，女，在读研究生，研究方向：中医药防治女性生殖内分泌疾病基础研究，E-mail：1171935855@qq.com

陶仕英(1970.09—)，女，副教授，研究方向：中医药防治女性生殖内分泌疾病基础研究，Tel：(010)64287538,E-mail：taoshiying1970@163.com

R-332；R271.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.040