李东娴++杜春华++牛延菲++曹红云++普冰清++游燕

【摘要】目的：研究大黄饮片微生物限度检查的方法。方法：按《中国药典》2015年版通则1105、1106、1107进行方法的建立和验证。结果：大黄饮片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢菌、乙型副伤寒沙门菌有一定的抑制作用，故需氧菌计数采用培养基稀释法进行检测，霉菌和酵母菌计数、耐胆盐革兰氏阴性菌、大肠埃希菌使用常规法进行检测，沙门菌检测中使用300mL胰酪大豆胨液体培养基进行增菌培养。结论：该方法可以用于大黄的微生物限度检查。

【关键词】大黄；微生物限度；方法适应性

【中图分类号】R284【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）07-0046-03

Validation on Microbial Limit Test Method of Chinese Rhubarb

LI DongxianDU ChunhuaNIU YanfeiCAO HongyunPU BingqingYOU Yan*

Yunnan Baiyao Group Innovation and R&D Center /Yunnan Institute of Materia Medica/Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming 650111， China

Abstract：Objective To research the microbial limit test ways for Chinese rhubarb. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia （2015 edition） General rule 1105，1106 and 1107.Results The validation on microbial limit test method of Chinese rhubarb suggest that Staphylococcus aureus， bacillus subtilis and Salmonella paratyphi B inhibitory effect. Medium dilution method couldbe used for total aerobic bacteria count. The conventional method couldbe used for total combined Molds and yeasts count， test for Escherichia coli and test for Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria. TSB （300mL） should be used for test for salmonella.Conclusion Thismethod can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for Chinese rhubarb.

Keywords：Chinese Rhubarb； Microbial Limit Test； Validation

中藥材的品质关系着中成药的质量和使用中药材患者的健康，《中国药典》2015版已经对中药提取物和中药饮片的微生物限度做出了规定[1]，但国内关于中药饮片微生物限度检查的研究却不多。

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L、唐古特大黄Rheum tanguticum Maximex Balf和药用大黄Rheum officinale Baill的干燥根茎，主要功效为泻下通便、清热解毒、活血化瘀等[2]，并具有一定的抑菌作用[3-8]。文献报道，大黄对幽门螺旋杆菌具有很强的抑菌活性[2]，大黄蒽醌衍生物也对葡萄球菌、链球菌有显著抗菌功效，药典中规定的方法适应性验证试验菌株如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌也可以在大黄蒽醌衍生物的抗菌谱中找到[4]，同时大黄对肺炎克雷伯菌[5]、沙眼衣原体[6]、粪肠球菌[7]等也有体外抑菌活性。

对具有抑菌作用的药品进行微生物限度检查方法适应性验证，一直是微生物检测工作中的难点，笔者对大黄饮片进行微生物检查法进行方法学考察，可以为研究中药材微生物限度检查法提供相关理论基础，并对含大黄的中成药的微生物限度检查具有一定的参考价值。

1实验材料

11样品大黄饮片（云南健之佳连锁健康药房，购买不同连锁店共3批药材，编号为1、2、3号样，经云南省药物所究所天然药物资源研究中心高级工程师邱斌鉴定来源于蓼科植物掌叶大黄Rheum palmalum L）。

12稀释剂及培养基pH 70氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、肠道增菌肉汤、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基，均购自广东环凯生物科技有限公司。

13菌种金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003 第3代〕、大肠埃希菌〔CMCC（B）44102 第4代〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501 第4代〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104 第3代〕和白色念珠菌〔CMCC（F）10123 第3代〕均由云南省食品药品检验所提供，黑曲霉[CMCC （ B） 98 003第3代]，由中国药品生物制品检定所提供。

2方法与结果

参照《中国药典》2015年版第四部非无菌产品微生物限度检查（1105、1106、1107）。

21菌液制备接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24h。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，20～25℃培养2～3d。取接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25℃培养5～7d。取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、白色念珠菌的新鲜培养物用09%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物，加入3～5mL含005%聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，之后用含005%聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液将孢子悬液稀释成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

22供试品的制备将购买的大黄饮片置于用酒精棉球擦拭过的万用粉碎机中，粉碎，用灭菌的药匙将大黄粉末移动至灭菌广口瓶中待用。

23供试液的制备取大黄粉末10g，加pH 70氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，制成1∶10供试液。依次稀释为1∶50、1∶100稀释液。

24计数方法适用性试验

241需氧菌总数计数方法适用性试验试验组取1∶10、1∶50、1∶100供试液99ML于灭菌试管中，加入制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液01mL，使其终浓度为每1mL含菌落数不大于100cfu的菌液，从试管中吸取1mL注入灭菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中30～35℃培养48h。每个菌种平行制备2个平皿，测定试验组的菌落数。

供试品对照组取1∶10、1∶50、1∶100供试液99mL于灭菌试管中，加pH 70氯化钠-蛋白胨缓冲液01mL，其余按试验组操作，测定供试品对照组的菌落数。

菌液对照组取pH 70氯化钠-蛋白胨缓冲液99mL于灭菌试管中，加入制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液01mL，使其终浓度为每1mL不大于100cfu的菌液，其余按试验组操作，测定菌液对照组的菌落数。

阴性对照组取pH 70氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL，加入霉菌平皿中，其余按试验组操作，平行做两个皿。

按[回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数]计算回收率。

可知，使用100mL胰酪大豆胨液体培养基进行增菌培养的方法不适用于大黄饮片沙门菌的检查，故采用薄膜过滤和增加增菌培养培养基体积的方法再次进行适用性试验。

244增加增菌培养培养基体积方法的适用性试验在薄膜过滤法中，供试液无法通过045微米孔径滤膜，该方法不适用于大黄的沙门菌检测，已是采用增加增菌培养培养基体积方法。

增菌培养使用200mL（300mL）胰酪大豆胨液体培养基。取大黄粉末10g，及乙型副伤寒沙门菌菌悬液1mL加入200mL（300mL）胰酪大豆胨液体培养基中，按药典相应控制菌项下的检查法进行适用性试验。结果顯示，增菌时使用体积为300mL的胰酪大豆胨液体培养基，可以用于大黄的沙门菌检查。

3讨论

药理研究[4]表明，大黄具有泻下、抑菌、抗肿瘤、双向调节血压等作用，本实验结果进一步证明了大黄的体外抑菌作用。现分别对大黄微生物限度检查方法的建立和对不同菌株的抑菌作用讨论如下。

31方法适应性验证结果分析实验结果表明，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢菌用1∶10普通平皿法进行方法适用性验证，回收率无法达到要求，需稀释至1∶50回收率才能达到2015版《中国药典》05～20的要求。沙门菌以100mL胰酪大豆胨液体培养基培养无法检出，需增加培养基至300mL方能检出。故大黄饮片的需氧菌总数应采用培养基稀释法，取1∶10稀释液1mL，每皿加05mL，作为1组，1∶10稀释级共做2组，1∶100及更高稀释剂按普通平皿法进行检测。霉菌和酵母菌总数使用普通平皿法进行检测；耐胆盐革兰阴性菌，可用胰酪大豆胨液体培养基稀释成1∶10进行预培养；大肠埃希菌和沙门菌分别使用100mL和300mL胰酪大豆胨液体培养基进行增菌培养。

32大黄饮片的抑菌作用大黄饮片对两种革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢菌有一定的抑制作用。文献报道，大黄对葡萄球菌有抑制作用[5]，与本实验结果相符。而大黄对于枯草芽孢菌的抑制作用，在此之前未见文献报道。文献关于大黄对副伤寒沙门菌的抑菌作用[6]，本实验也得到了相同的结论。另外，关于大黄对大肠埃希菌及铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌的抑制作用，文献中有不同说法[7-8]，本实验中并未发现大黄对大肠埃希菌及铜绿假单胞菌有抑制作用，但由于按2015版《中国药典》中控制菌检测相关规定，大肠埃希菌检查时加入胰酪大豆胨液体培养基中及耐胆盐革兰阴性菌检查时加入肠道增菌肉汤中培养的样品量均为1g，而沙门菌检测加入胰酪大豆胨液体培养基中的样品量为10g。可能由于大肠埃希菌和铜绿假单孢菌实验中加入的样品量较少，而没有表现出大黄对这两种菌株的抑制作用。

国内原料药材和饮片的微生物限度检查工作尚处于起步阶段，笔者对具有抑菌性的大黄饮片微生物限度方法学适用性验证进行研究，有助于促进中药材及中药饮片微生物限度标准的进一步完善。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典（2015版）[S].北京：中国医药科技出版社，通则1107：149-151.

[2]江苏新医学院.中医学[M].南京：江苏人民出版社，1972：148.

[3]Ma F， Chen Y， Li J， et al. Screening test for anti-Helicobacter pylori activity of traditional Chinese herbalmedicines[J]. World J Gastroenterol， 2010， 28（16）：5629.

[4]徐采凤.大黄的临床应用[J].内蒙古中医中药，2014（8）：56.

[5]穆廷杰，杨芬兰，金海红，等. 连翘等中草药对肺炎克雷伯菌作用的实验研究及临床应用[J].西部中医药，2015，28（9）：19-21.

[6]李建红，黄敏，薛耀华，等. 大黄及黄柏提取物体外抗沙眼衣原体活性研究[J].中华中医药杂志，2015，8，30（8）：2935-2938.

[7]彭苑霞，刘晓强，温羚玲，等. 大黄等5味中药及单体成分对临床多重耐药菌的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（22）：103-107.

[8]李娜.探究常见抗菌中草药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用[J].中国实用医药，2015，10（11）：181-182.

（收稿日期：2017-02-13编辑：穆丽华）