陈秋娟，谢微，罗杨合，李金凤，王胜新，全耀

（1.贺州学院化学与生物工程学院，广西贺州542899；2.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899）

不同提取方法对马蹄皮总提取物抗氧化活性的影响

陈秋娟1，谢微2，*，罗杨合2，李金凤1，王胜新1，全耀1

（1.贺州学院化学与生物工程学院，广西贺州542899；2.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899）

利用不同提取方法提取获得马蹄皮总提取物，研究不同提取物的总还原能力和羟自由基清除能力。结果显示：不同提取物均具有不同程度的总还原能力和羟自由基清除能力，且均具有量效关系，表明不同提取物均具有一定的抗氧化能力；其中，抗氧能力最强的是用酸性乙醇作提取剂微波辅助提取的提取物。

马蹄皮；总还原能力；羟自由基；抗氧化

马蹄（Water chestnuts），又称荸荠、地栗、乌芋等，属莎草科多年水生草本植物的地下球茎。马蹄富含有人体需要的多种营养成分，具有润肺、消食、降血压、润肠通便等作用[1-2]。目前，我国马蹄产量占世界总量的95%以上[3]。人们主要将马蹄用于马蹄罐头、马蹄糕，即食马蹄糊的生产，以及加工成各种马蹄保健品、马蹄营养饮料等产品[3]，然而在马蹄的加工过程中，占鲜马蹄质量20%～25%的马蹄皮除少量用作饲料外，大部分都被作为废弃物丢弃[4]。

活性氧自由基是一种氧化活性相当强的物质，容易引起机体衰老，诱发各种恶性疾病等[5]。其中，羟自由基（·OH）是最活泼的活性氧自由基之一，可以通过电子转移、加成以及夺取氢原子和羟基化等反应，引起蛋白质、氨基酸和脂类等物质出现氧化性损伤。食用抗氧化性食品对抑制因活性氧自由基引起的心脑血管等疾病具有一定的预防和治疗作用，但是，目前被广泛应用的食品抗氧化剂大部分是人工合成的，其安全性不足[6]。因此开发安全可靠的天然抗氧化剂成为一种迫切需要。

研究表明，许多植物的果皮及果核都表现出优良的抗氧化性能[7]。马蹄皮作为马蹄加工过程中产生的废弃物，其提取物具有良好的抗氧化能力[8-10]。随着科学研究的不断深入，关于马蹄皮提取物抑菌作用[11-12]和抗氧化性能的研究越来越多。提取物对羟自由基的清除能力是评价其抗氧化能力强弱的重要指标之一[13]。同时，研究已证实还原能力与抗氧化能力具有一定的关联性，并且可以反映内源抗氧化能力的变化，也是评价抗氧化活性的重要指标。一定程度上，还原能力越强，越不容易被氧化，抗氧化性就越高。目前，关于马蹄皮的研究主要是提取工艺的研究，而关于不同提取方法对马蹄皮提取物抗氧化活性影响的研究鲜有报道。

本文利用酸性乙醇（70%，pH=2，体积分数）、乙醇（70%，体积分数）、乙酸乙酯3种提取剂，分别采用普通浸提、微波辅助提取、超生波辅助提取3种方法进行提取，研究不同马蹄皮提取物的总还原能力和对羟自由基的清除能力，据此判断不同提取物的抗氧化能力差异，由此得出最佳的提取方法，以更好地开发利用马蹄皮资源，为天然抗氧化剂及抗氧化保健食品的开发研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

马蹄皮：收集于贺州市八步区中心市场。

碳酸钠：天津市鼎盛鑫化工有限公司；无水乙醇：天津市鼎盛鑫化工有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：天津市凯通化学试剂有限公司；三氯乙酸：天津市北辰方正试剂厂；30%H2O2、盐酸、氯化钠：西陇化工股份有限公司；乙酸乙酯：杭州新方五交化有限公司；铁氰化钾、抗坏血酸、三氯化铁：杭州新方五交化有限公司；硫酸亚铁、水杨酸：广州市承跃贸易有限公司；以上药品均为分析纯；试验用水为蒸馏水。

CW-2008型多功能微波反应萃取仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；JY·99-IIDN型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；RE52CS型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；JP-250A-8型高速多功能粉碎机：永康市久品工贸有限公司；FA1004型电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；TDL-80-2B型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；HHS型水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 同种提取方法不同提取剂提取物的制备

挑选无腐烂马蹄，清洗后去皮，收集马蹄皮放在阴凉处自然风干后，粉碎备用。称量马蹄皮粉末8.0 g若干份，置于250 mL锥形瓶，分别加入160 mL（1∶20，g/ mL）70%酸性乙醇（pH=2）、70%乙醇和乙酸乙酯，提取方法选择50℃普通浸泡提取2 h，趁热减压抽滤，滤渣再提取2次，每次提取1 h，分别将滤液合并，把滤液置于旋转蒸发仪中蒸发至恒重，获得浸膏状提取物备用。

1.2.2 同种提取剂不同提取方法提取物的制备

挑选无腐烂马蹄，清洗后去皮，收集马蹄皮放在阴凉处自然风干后，粉碎备用。称量马蹄皮粉末8.0 g若干份，置于250 mL锥形瓶，加入160 mL（1∶20，g/mL）70%酸性乙醇（pH=2），分别用微波萃取仪（260 W、2 min、50℃）提取和超声波细胞粉碎机（260 W、20 min、50℃）提取，抽滤后滤渣再提取2次，分别将滤液合并，把滤液置于旋转蒸发仪中蒸发至恒重，获得浸膏状提取物备用。用同样的方法制备乙醇不同提取方法提取物。由于乙酸乙酯作提取剂，其提取物的抗氧化效果不佳，因此不再做不同提取方法的比较研究。

1.2.3 总还原能力

参照文献[5]的方法，在8支试管中分别加入3.0mL pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液，加入质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的样品溶液3.0 mL，再分别加入1%的铁氰化钾溶液3.0 mL；混合物在50℃恒温20 min后，分别加入3.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以2 500 r/min离心分离5 min，取上清液5.0 mL，加蒸馏水6.0 mL和0.1%FeCl3溶液2.0 mL，在700 nm处测量吸光度值，用蒸馏水代替样品溶液进行还原能力参比测定试验。吸光度越高表明其还原能力越强。每个样品平行测定3次，取平均值。以相同浓度的VC作阳性对照。

1.2.4 羟基自由基清除能力

参照文献 [5]，在8支试管中分别加入浓度均为2.0 mmol/L的FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液各1.0 mL，分别加入1.0 mL质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的样品溶液，加蒸馏水至5.0 mL，再分别加入2.0 mmol/L H2O22.0 mL，在37℃水浴下反应60 min后，用蒸馏水作参比，于510 nm处测吸光度值。每个样品平行测定3次，取平均值。以相同浓度的VC作阳性对照。清除率计算公式为：

清除率/%＝（A0-A1/A0）×100

式中：A0为空白样液吸光度；A1为样液吸光度。

2 结果与分析

2.1 马蹄皮不同提取物总还原能力的测定

2.1.1 同种提取方法不同提取剂提取物总还原能力的测定结果

分别准确称量不同浸膏状提取物配制成所需浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根据1.2.3方法测定不同提取物还原能力的大小，结果如图1所示。

图1 同种提取方法不同提取剂提取物总还原能力Fig.1 Total reducing power of different extraction agents extract for the same extraction method

由图1可知，1）在试验质量浓度范围内，3种不同提取物均具有一定的总还原能力，并且3种提取物的总还原能力均随着提取物质量浓度的增大而增强，存在剂量-效应关系；2）在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL范围内，3种不同提取物的总还原能力相差不大；在2.5 mg/mL～ 4.0 mg/mL范围内，3种不同提取物的总还原能力相差较大；3）在相同浓度条件下，不同提取物的总还原能力强弱顺序依次为酸性乙醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物，但各提取物的总还原能力均比VC弱。还原能力的测定结果表明马蹄皮提取物中含有一定数量的还原性物质，说明不同提取剂由于极性、分散性等性质的差异，对马蹄皮多酚、黄酮等植物还原性化学成分的提取具有选择性。由此可知用酸性乙醇作提取剂，提取物的总还原能力更强。

2.1.2 同种提取剂不同提取方法提取物总还原能力的测定结果

分别准确称量不同浸膏状提取物配制成所需浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根据1.2.3方法测定不同提取物总还原能力的大小，结果如图2和图3所示。

由图2和图3的测定结果可知，同种提取剂不同提取方法提取物均表现出不同程度的总还原能力，但其清除能力均比VC弱。在相同浓度条件下，同种提取剂不同提取方法提取物的总还原能力强弱顺序依次为VC＞微波提取物＞超声波提取物＞普通提取物。在试验浓度范围内，不同提取物的总还原能力均随浓度的增加而增强，存在较明显的剂量-效应关系。

图2 酸性乙醇不同提取方法提取物总还原能力Fig.2 Total reducing power of different extraction agents extract for acidic ethanol

图3 乙醇不同提取方法提取物总还原能力Fig.3 Total reducing power of different extraction agents extract for ethanol

两种提取剂的超声波提取物的总还原能力均优于普通提取物，而微波提取物的总还原能力又均优于超声波提取物。这可能是因为微波辅助提取和超声波辅助提取可以促进马蹄皮中还原性物质的溶出，微波处理后对样品中的活性成分影响较小。与普通浸提法相比，超声波和微波辅助提取法都能明显缩短提取时间，特别是微波提取，既能大大缩短提取时间，又能保留还原性物质的还原能力。因此微波辅助提取法更适宜用于马蹄皮活性物质的提取。

2.2 马蹄皮不同提取物对羟自由基的清除能力

2.2.1 同种提取方法不同提取剂提取物对羟自由基的清除能力

分别准确称量不同浸膏状提取物配制成所需浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根据1.2.4方法测定，结果如图4所示。

图4 同种提取方法不同提取剂提取物对羟自由基的清除能力Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability to different extraction agents extract of the same extraction method

由图4可知：1）在相同浓度下，酸性乙醇和乙醇提取物对羟自由基的清除能力相差不大，酸性乙醇提取物对羟自由基的清除能力略高于乙醇提取物，而乙酸乙酯提取物对羟自由基的清除能力明显比酸性乙醇提取物和乙醇提取物差；其中在4 mg/mL浓度下，不同提取剂提取物的清除顺序依次为酸性乙醇（64.42%）＞乙醇（62.29%）＞乙酸乙酯（36.06%）；2）在试验浓度范围内，3种不同提取物都具有不同程度的羟自由基清除能力，3种不同提取物对羟自由基的清除率均随浓度的增加而增大，但各提取物的清除能力均弱于VC。乙醇提取物的清除能力比乙酸乙酯的强，这是因为马蹄皮提取物中的活性物质，如多酚类、黄酮类等化合物大部分都是极性较强的物质，所以易溶于极性较强的乙醇溶液中；而酸性乙醇提取物的羟自由基清除能力又比乙醇提取物的清除能力强，这是因为马蹄皮提取物中的活性成分：多酚类、黄酮类等化合物，更易溶于酸性条件下的乙醇溶液中[14-16]。从试验结果上来看，酸性乙醇（70%，pH=2）提取物的抗氧化能力最强。因此，与乙醇和乙酸乙酯相比，用酸性乙醇作提取剂，其提取物的抗氧化效果更佳，适宜推广。

2.2.2 同种提取剂不同提取方法提取物对羟自由基的清除能力

分别准确称量不同浸膏状提取物配制成所需浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）提取液。根据1.2.4方法测定，不同提取物对羟自由基的清除能力结果如图5和图6所示。

由图5和图6可知，酸性乙醇-普通提取物、酸性乙醇-超声波提取物、酸性乙醇-微波提取物和乙醇-普通提取物、乙醇-超声波提取物、乙醇-微波提取物均具有不同程度的羟自由基清除能力，但其清除能力均比VC弱。在相同浓度条件下，同种提取剂不同提取方法提取物的羟自由基清除率顺序依次为VC＞微波提取物＞超声波提取物＞普通提取物。在试验浓度范围内，提取物的浓度与羟自由基清除率存在明显的剂量-效应关系。

图5 酸性乙醇不同提取方法提取物对羟自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging ability to differentextraction agents extract of acidic ethanol

图6 乙醇不同提取方法提取物对羟自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability to different extraction agents extract of ethanol

由图5和图6的测定结果可知，超声波提取物的抗氧化能力比普通提取物的强，而微波提取物的抗氧化能力又比超声波提取物的强。

3 结论

本试验利用酸性乙醇、乙醇、乙酸乙酯3种提取剂，分别采用普通浸提、微波辅助提取、超生波辅助提取3种方法进行提取，获得马蹄皮总提取物。通过研究不同提取物的总还原能力和羟自由基清除能力，得出不同提取物均具有不同程度的总还原能力和羟自由基清除能力，且均随浓度的增加而提高，表明不同提取物都具有不同程度的抗氧化能力；其中，用酸性乙醇作提取剂微波辅助提取的提取物抗氧化能力最强。微波辅助提取不仅显著缩短了提取时间，提高了工作效率，降低消耗的成本，而且保留了马蹄皮提取物的抗氧化活性，具有很高的经济效益和科研价值。因此用酸性乙醇作提取剂和微波辅助提取法来获取马蹄皮总提取物，是一条高效开发利用废弃马蹄皮资源的有利途径，为我们合理开发高附加值天然抗氧化保健品、药品和研制安全可靠的食品天然抗氧化剂提供理论依据。

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The Influence to Antioxidant Activity of Total Extract of Eleocharis Tuberose Peel with Different Extraction Methods

CHEN Qiu-juan1，XIE Wei2，*，LUO Yang-he2，LI Jin-feng1，WANG Sheng-xin1，QUAN Yao1
（1.School of Chemical and Biological Engineering，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.Research Institute of Food Science&Engineering Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

It was to study the total reducing ability of different extractives and their scavenging activity to hydroxyl radical by utilizing different extraction methods to obtain total extract of eleocharis tuberose peel in this thesis. The result showed that different extractives have different total reducing abilities and scavenging activities to hydroxyl radical.There was a dose-effect relationship between total reducing ability and scavenging activity to hydroxyl radical which showed different extractives have certain antioxidant ability.Among them，the strongest an tioxidant ability was using acidic ethanol as extracting agent extracts of microwave assisted extraction.

eleocharis tuberose peel；total reducing ability；hydroxyl radical；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.005

2016-07-27

广西高校科学技术研究项目（KY2015LX477）；贺州学院校级课题（2014ZC28）；广西自治区大学生创新创业训练计划项目（201511838090）

陈秋娟（1983—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物提取、纯化与分析。

*通信作者：谢微，女（壮），助理研究员，研究方向：分析检测。