雷燕，张湘娥，敬霖志

（1.海南椰岛酒业发展有限公司研发部，海南海口570105；2.苏州昊德生物科技有限公司，江苏苏州215123）

酸水解法测定保健酒中的总皂苷含量

雷燕1，张湘娥1，敬霖志2

（1.海南椰岛酒业发展有限公司研发部，海南海口570105；2.苏州昊德生物科技有限公司，江苏苏州215123）

为了开发测定保健酒中总皂苷含量更准确的分析方法，将保健酒中皂苷用反相固相萃取法从酒体中分离出来；所得的皂苷提取物用酸水解后，再用溶剂萃取得到苷元；最后用香草醛-硫酸比色法，以人参皂苷Re为标准，测定总苷元含量。结果表明，人参皂苷元（Re）在6.8～91μg/m L范围线性关系良好，y= 0.011x+0.012（R2=0.999），平均加标回收率为99.15%，RSD值为1.91%，精密度、重复性良好。皂苷经水解后消除了糖基对香草醛显色剂的干扰，提取苷元过程采用液液萃取的方式可将保健酒A中的色素完全除去。方法稳定，可作为保健酒中总皂苷的检测及其活性中药成分含量的质量控制的检测方法。

保健酒；总皂苷；苷元；香草醛-硫酸显色

保健酒（Liqueurs）是由基酒加中药配制而成，具有抗疲劳，调节免疫力之功效。保健酒将中药功能与酒的作用有效结合，极大地增强了药物的效能与作用，药借酒势，酒助药威，迅速增强人体微循环（扩张毛细血管），使有效成分直达病灶，诸多症状可迅速得到缓解或消失。保健酒的生物活性成分通常来自传统中药，特别是有滋补作用的中药。总皂苷即为保健酒中重要的功效成分，“皂苷”是由甾体或三萜类化合物作为苷元与糖分子缩合而成的一类低聚糖苷[1-2]，是一类广泛存在于植物细胞内的有机化合物，它具有调节肾脏功能，抗缺氧和抗疲劳、抗低温应激作用、抗脂质氧化作用、抗致突变作用及双向调节免疫的保健功能[3]。

总皂苷的现有检测标准为2003版《保健食品检验与评价技术规范》，该法是针对保健食品中“总皂苷”含量测定的一个广泛方法。皂苷结构中的糖基本身可与香草醛发生显色反应，保健酒中含有多种不同糖基数的皂苷致使与香草醛出现显色结果差异。为消除糖基对香草醛显色剂的干扰，本研究在卫生部方法[4]的基础上将保健酒中皂苷水解成不含有糖基的苷元[5-6]再与硫酸-香草醛显色[7]，从而达到准确检测保健酒样中总皂苷含量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

供试品与对照品：保健酒A，海南椰岛酒业发展有限公司提供；人参皂苷Re，中国药品生物制品检定所。

仪器设备：莱伯泰科UV2000型紫外分光光度计；十万分之一分析天平（Mettler Toledo XS205DU）；万分之一天平（Mettler Toledo AL204-IC）；漩涡混悬器（VELPZX3）；固相萃取仪（supelco 12管路）；隔膜真空泵（Ameritech AVP-7120）；氮吹仪（上海安谱DC-12）；旋转蒸发仪（上海申顺生物科技R-201）。移液枪；塑料离心管；50m L圆底烧瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18OH，500mg 3m L，50/ PK，Agilent Technologies)。

试剂耗材：香草醛（基准试剂）二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、盐酸为分析纯；77%硫酸溶液（v/v）；氯化氢水溶液（4mol/L）；70%甲醇水溶液（v/v）。

香兰素硫酸显色中间液：准确吸取8%香兰素甲醇溶液500μL加入3000μL的77%硫酸溶液中，振荡混合均匀，冷却至室温，现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备

1.2.1.1 皂苷苷元溶液的制备

精密称取人参皂苷Re适量，用甲醇定容，配制成人参皂苷Re对照品溶液（4mg/m L），精密移取500μL的乙腈于塑料离心管中，加入盐酸（4mol/L）500μL，涡旋混匀得到水解溶剂，再往其中加入4 mg/L的Re对照品溶液1 m L，涡旋混匀后放入80℃恒温水浴3 h，冷却后加入5m L的二氯甲烷和3m L的去离子水，有机相用3m L水洗两遍，分离去掉水层(上层)。二氯甲烷有机相层经氮吹仪吹干，用2m L乙腈溶解，得到浓度为1.0mg/m L的人参皂苷苷元溶液。

1.2.1.2 苷元标准曲线工作溶液

分别准确吸取苷元溶液（1.0 mg/m L）75μL、 150μL、300μL、600μL于刻度试管中，用乙腈定容至1m L，涡旋混匀，得到浓度为0.075mg/m L、0.15mg/m L、0.30mg/m L、0.60mg/m L的苷元标准工作溶液，现配现用。

1.2.1.3 显色

分别准确吸取浓度为0.075mg/m L、0.15mg/m L、0.30mg/m L、0.60mg/m L的苷元标准曲线工作溶液500.0μL加入到4.5m L的香草醛硫酸显色中间溶液中，涡旋混匀，同时吸取500.0μL的乙腈按照上述步骤操作，得到溶剂空白显色组。所得混合物于70℃水浴加热10m in后迅速放入冰水中冷却30 s，检测溶液在541 nm（扫描最大吸收波长）波长下的吸光度,每个样品平行测定3次。

1.2.2 供试品溶液的制备

1.2.2.1 皂苷提取

准确吸取1.0m L保健酒A于瓷蒸发皿中，水浴挥干乙醇和水，所得固体用1.0 m L水溶解，备用。将此样品溶液加入经激活的萃取小柱中，然后用6m L去离子水洗涤，保持1～2滴/s的速度除去样品中的糖类物质。再分别用70%甲醇水溶液（6m L）和甲醇(10 m L)进行洗脱，收集洗脱液于圆底烧瓶中。在旋转蒸发仪上除去甲醇和水，所得固体用甲醇1.0 m L溶解备用。

1.2.2.2 水解

精密移取500μL的乙腈于15m L塑料离心管中，加入盐酸500μL，涡旋混匀得到水解溶剂，加入上述酒样甲醇溶液1m L，涡旋混匀后放入80℃恒温水浴3 h，冷却至室温后加入5m L的二氯甲烷和3m L的去离子水，有机相用3m L水洗两遍，分离去掉水层(上层)。二氯甲烷有机相层经氮吹仪吹干，用2m L乙腈溶解得到酒样水解的苷元溶液。

1.2.2.3 显色

分别准确吸取500.0μL酒样苷元乙腈溶液加入到4.5m L的香草醛-硫酸显色中间溶液中，混合均匀，所得混合物于70℃水浴中加热10min后，迅速放入冰水中冷却30 s，上机测定吸光度，每个样品平行测定2次。

1.2.2.4 计算

式中：X——酒样中总皂苷的含量，mg/100m L；

A标——紫外分光光度计测定的校准溶液的吸光度值；

A样——紫外分光光度计测定的样品吸光度值；

C标——显色体系中校准溶液的浓度，μg/m L；

946.55 ——人参皂苷Re的摩尔分子量，g/mol；

476.73 ——人参皂苷水解成苷元的摩尔分子量，g/ mol；

V1——酒样溶液的配制过程中酒样苷元乙腈溶液的定容体积，m L；

V2——测定吸光度过程中吸取酒样苷元乙腈溶液的体积，m L；

V3——测定吸光度过程中香草醛硫酸显色中间溶液的体积，m L。

2 方法学验证

2.1 线性关系考察

以1.2.1.3中苷元标准曲线工作溶液显色体系中的浓度（7.5μg/m L、15μg/m L、30.0μg/m L、60.0μg/m L、100.0μg/m L）为横坐标（X），测定的吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

2.2 精密度考察

精密吸取0.15 mg/m L的皂苷苷元溶液500.0μL，按照1.2.2.3步骤操作显色并测定吸光度(显色液中苷元浓度为15μg/m L)，重复测定6次，测定RSD值。

2.3 重复性考察

取试样1.0 m L酒样，按照1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3前处理及显色步骤平行处理6份测定吸光度，测定RSD值。

2.4 稳定性考察

精密吸取0.15mg/m L的皂苷苷元标准曲线工作溶液500.0μL按照1.2.2.3步骤操作显色，在指定时间间隔下（30 m in）观察吸光度值的变化，测定RSD值。

2.5 加标回收实验

取保健酒样A 1.0 m L，按照1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3步骤操作，测定保健酒中总皂苷的含量。精确吸取人参皂苷Re标准溶液（3.6mg/m L）1.5m L于10m L的容量瓶中，用保健酒A定容至刻度。精确吸取上述加标样品1m L，平行做3份于100m L的瓷蒸发皿中，水浴挥干乙醇和水，用1m L去离子水溶解，按照1.2.2.1、1.2.2.2提取、水解，再精确吸取500μL上述加标酒样苷元乙腈溶液2份按照1.2.2.3显色测定，平行测定3次，测定加标样品的总皂苷含量并计算加标回收率。

3 方法可行性分析

3.1 线性关系的考察

实验结果表明，人参皂苷苷元的浓度在7.5～100.0μg/m L之间呈良好的线性关系。线性回归方程为y=0.011x+0.012，R2为0.999。

3.2 精密度考察（图1、表1）

图1 人参皂苷苷元标准曲线

表1 精密度实验结果(n=6)

由表1可知，6次测定的RSD值为0.579%，说明酸水解皂苷显色法测定皂苷含量的精密度良好。

3.3 加标回收实验（表2）

由表2加标回收实验结果可知，加标样品平行处理6份，测定平均加标回收率为99.15%，RSD值为1.91%，说明酸水解皂苷显色法测定皂苷含量的准确度较好。

3.4 重复性考察（表3）

由表3可知，平行处理6份样品测定皂苷含量，RSD值为2.25%，说明酸水解皂苷显色法测定总皂苷含量的方法重复性较好。

3.5 稳定性考察（表4）

由表4可知，供试样品10次测定吸光度值的RSD值为0.634%，说明供试样品在0.5 h内较稳定。

表4 稳定性实验结果(n=10)

4 讨论

本实验将保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基对香草醛显色剂的干扰，采用液液萃取方式提取苷元的同时除去了酒样中的干扰色素。实验采用皂苷酸水解显色法测定保健酒A中的总皂苷含量，以水解后的人参皂苷苷元制备标准曲线。此改良法具有范围线性良好、准确度高、精确度好、重复性良好等优点，因此非常适合用于保健酒中总皂苷含量的定量分析和质量控制。

[1]凌关庭.保健食品原料手册[M].北京：化学工业出版社, 2002：436-438.

[2]孙耀军,邹建.皂苷不同测定方法比较[J].食品科技,2009 (2)：30-33.

[3]谭世强,谢敬宇,郭帅,等.三萜类物质的生理活性研究概况[J].中国农学通报,2012,28(36)：23-27.

[4]保健食品检验与技术评价[M].中华人民共和国卫生部, 2003：306-307.

[5]吴芬,赵大云,史贤明.利用皂苷元特征显色测定苜蓿皂苷含量的快速检测方法[J].上海交通大学学报(农业科学版),2006,24(3)：226-229.

[6]黄敏,张丽,毛卫红.一种水解人参总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法：102993258A[P].2013-03-27.

[7]张小鸿,吴杨峥,徐先祥.不同显色剂对牛膝总皂苷含量测定的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013(11)：114-116.

Determ ination of Total SaponinsContent in Healthcare Liqueur by Acid-HydrolysisM ethod

LEIYan1,ZHANG Xiange1and JING Linzhi2
(1.R&D Departmentof YedaoWine Industry Co.Ltd.,Haikou,Hainan 570105; 2.Suzhou Kosmode BiotechsCo.Ltd.,Suzhou,Jiangsu 215123,China）

To find a bettermethod for the determination of total saponins content in healthcare liqueur,saponinswere separated from the liqueur by SPME,the isolated saponinswere acid-hydrolyzed and then extracted by organic solvent,and aglyconeswere obtained, then aglyconesweremeasured by vanillin-sulfuric acid colorizationmethod and total saponins contentwas obtained eventually w ith ginsenonside Re as the reference standard.The results suggested that Re showed a good linear relationship w ithin the range of 6.8 to 91µg/m l,the linear equation was y=0.011x+0.012(R2=0.999),the average recovery was 99.15±1.9%,and RSD was 1.91%.The precision and the repeatability of thismethod was good.Besides,acid-hydrolysis of saponins could elim inate the interference of sugar on vanillin aswellas the pigments from other ingredients in healthcare liqueur.

healthcare liqueur;totalsaponins;aglycone;vanillin-sulfuric acid colorization

TS262.91；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0096-04

10.13746/j.njkj.2016359

2016-12-02

雷燕(1985-)，女，本科，化工助理工程师，主要从事产品分析、质量技术方面的研发。

优先数字出版时间：2017-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170125.0757.005.htm l。