吴永平

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、慢性粒细胞白血病（CML）以及原发性骨髓纤维化（PMF）、慢性中性粒细胞白血病（CNL）、肥大细胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒细胞白血病（CEL）和不能分类的MPNs。

JAK2介导包括红细胞生成素（EPO ）、血小板生成素（TPO ）、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF ）、生长因子（GH） 、白细胞介素3 （ IL-3 ）在内的多种细胞因子的信号转导，并通过JAK2-STAT途径促进或者调节细胞的增殖。研究发现JAK2V617F突变在多种恶性血液病中都有发现，本课题通过合成的JAK2V617F特异性引物，用PCR以及基因测序等方法检测其突变，对进一步阐明其引发的广谱的血液病提供临床诊断及治疗依据。

1 方法：

1.1 病例收集：收集我院住院确诊的相关患者，共46例。其中PV组8例；ET组12例；CML组4例；PMF组2例；CNL组6例；CEL组2例；嗜碱性粒细胞增多症（basophilia）组1例；AML组3例；ALL组8例；10例健康志愿者对照。各型白血病诊断标准均参照WHO制定的最新相关标准，其中PV，ET和PMF诊断标准[1]

1.2 仪器与试剂：定性PCR扩增仪：美国Bio-Rad公司Thermal Cycler C1000型。电泳仪：美国Bio-Rad公司 Basic型。凝胶成像分析系统：美国UVP公司EC3 Chemi HR 410 Imaging System。测序仪：美国ABI公司3500。DNA Marker、2×Taq PCR MarkerMix、血液基因组提取试剂盒购自南京凯杰基因。

1.3 引物序列如下，上海invitrogen合成：

F1：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′；

F2：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′；

R：5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。

1.4 抽取患者和正常对照外周血（骨髓）2mL，提取基因组DNA，采用等位基因特异性PCR（AS-PCR），取5μLPCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳后用美国UVP公司EC3凝胶成像分析系统分析图像、摄像并保存结果。

2 结果

2.1 阴性、阳性的判断

JAK2V617F基因突变PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果出现364bp和243bp2条条带者为阳性，出现364bp一条条带者为阴性。如图3。

2.2 PV组阳性率为87.5%（7/8），ET组阳性率为33.3%（4/12），PMF组阳性率为50%（1/2） ，AML、ALL、CML、CNL、CEL等恶性血液病患者及正常对照均为阴性。……