张媛华

摘要：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）参与多种植物生理过程，但在气孔运动中的研究相对较少，且与过氧化氢（H2O2）在脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导气孔关闭中的关系尚不清楚。通过PTK激酶的抑制剂和H2O2的清除剂及合成抑制剂的使用，初步研究了PTK在ABA诱导气孔关闭中的作用及与H2O2的相互关系。酪氨酸蛋白激酶抑制剂木黄酮（genistein）和tyrphostin A23抑制ABA和外源H2O2诱导的气孔关闭，且能够促进ABA诱导关闭的气孔重新开放。PTK参与ABA诱导的气孔关闭，且通过调控保卫细胞内H2O2水平进而调控气孔运动。

关键词：PTK激酶；ABA；H2O2；气孔；蚕豆

中图分类号： Q945.19文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0077-02

酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一种能有选择性地使不同底物的酪氨酸残基磷酸化的一种酶。正常情况下，细胞的酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶拮抗调节维持平衡的。相对于动物细胞中的研究而言，植物中的蛋白酪氨酸激酶起步较晚，仅有少量报道[1-2]。[JP2]Zi等证实酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂PAO和酪氨酸蛋白激酶抑制剂木黄酮能够抑制花粉萌发和花粉管的生长，并且导致花粉管不同程度的畸变[1]。随后Yemets等证明，PTKs抑制剂（除莠霉素A、木黄酮及tyrphostin AG18）均可能通过影响根毛中的皮质微管结构进而改变根毛的生长和发育[2]。然而Ghelis等的结果提示了PTKs抑制ABA诱导的气孔关闭，但是关于其机制却不清楚[3]。因此，本试验就PTK在脱落酸（ABA）诱导气孔关闭中与H2O2的相互关系进行初步研究。[JP]

1材料与方法

木黄酮、tyrphostin A23、过氧化氢酶（catalase，CAT）、DPI（二苯基氯化碘盐，diphenyleneiodonium chloride）、MES[2-（N-吗啉）乙磺酸，2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid]均购自 Sigma 公司，H2DCF-DA（2′，7′-二氯荧光素-3′，6′-二乙酸酯，2，7-dichlorofluorescein diacetate）购自Biotium公司，DMSO（二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide）购自 Amresco 公司，其他均为国产分析纯试剂。

1.1材料培养

蚕豆（Vicia faba L.）种子经消毒、催芽后培养于光照培养箱中。培养箱光—暗周期设定为14 h—10 h，光照度为 300 μmol/（m2·s），温度为25 ℃/18 ℃，相对湿度75%。幼苗生长期间浇水1次/d。取4周龄植株茎顶端完全展开的第1对叶片用于试验分析。

1.2气孔分析

气孔分析参照McAinsh等的方法[4]进行。测量时随机选取5個视野，每个视野随机选取6个气孔。每个处理重复3次，所得数据计算平均数和标准误差。

2结果与分析

2.1ABA诱导气孔关闭

由图1可见，ABA能明显促进光下的气孔关闭。随ABA浓度的增加，抑制程度增大。与对照相比，1、5、10、15 μmol/L 分别抑制了23.5%、35.5%、47.9%、51.5%。考虑到 10 μmol/L 已对气孔产生很好的抑制效果，随后的试验中均采用此浓度。

2.2木黄酮和tyrphostin A23抑制ABA诱导的气孔关闭

木黄酮和tyrphostin A23是PTK激酶的专一性抑制剂。图2结果表明，不同浓度的木黄酮（图2-a）和tyrphostin A23（图2-b）均可明显抑制ABA诱导的气孔关闭。与对照相比，最低浓度10 μmol/L的木黄酮和tyrphostin A23促进气孔开放分别达24.1%和26.6%。且随浓度升高，抑制ABA的程度呈剂量依赖型增大。至150 血酸ASA和过氧化氢酶CAT能明显抑制该过程，而过氧化氢产生酶NADPH氧化酶的抑制剂DPI却不能抑制该过程。该结果表明，清除保卫细胞中的H2O2能够促进气孔开放。而H2O2诱导的气孔关闭同样被木黄酮和tyrphostin A23所抑制，表明木黄酮和tyrphostin A23可能通过类似清除的方式促进气孔开放。

[HTK]2.4木黄酮和tyrphostin A23促进ABA诱导关闭的气孔重新开放[HT]

研究表明，ABA能够促进保卫细胞的产生和H2O2的积累进而诱导气孔关闭[5]。而图4显示，100 μmol/L 木黄酮和tyrphostin A23不仅抑制ABA诱导的气孔关闭，且能够促进ABA已经诱导关闭的气孔重新开放。同样，H2O2的清除剂抗坏血酸ASA和过氧化氢酶CAT也能逆转ABA关闭的气孔重新开放，而H2O2产生酶-NADPH氧化酶的抑制剂DPI却不能逆转该过程（图4）。结果表明，木黄酮、tyrphostin A23与H2O2的清除剂ASA和CAT二者作用结果相似，推测木黄酮、

tyrphostin A23可能通过清除保卫细胞内部H2O2的方式逆转ABA诱导关闭的气孔重新开放。

木黄酮和tyrphostin A23作为2种特异的PTK激酶抑制剂，能够有选择地抑制PTK激酶的活性[6-7]。本研究结果显示，ABA诱导的气孔关闭可被PTK激酶的抑制剂木黄酮和tyrphostin A23抑制，表明PTK激酶参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭。该结果与Ghelis等在拟南芥中的研究结果[3]一致。

H2O2作为一种重要的信号分子参与多种环境因子和植物激素诱导的气孔关闭[8-9]。本试验研究结果表明，木黄酮和tyrphostin A23是通过类似于H2O2清除剂ASA和CAT清除保卫细胞内H2O2的方式抑制外源过氧化氢诱导的气孔关闭，而不是通过抑制H2O2生成的方式参与气孔运动（图3、图4）。该结果表明，PTK激酶的活性可能通过促进H2O2的积累进而参与ABA诱导的气孔关闭。此外，木黄酮和tyrphostin A23能够逆转ABA诱导已关闭的气孔重新开放，效应也同ASA和CAT相似，异于DPI。该结果不仅进一步证实了上述推测，还表明木黄酮和tyrphostin A23可能具有清除细胞内H2O2的功能，与PTK通过磷酸化肌动蛋白参与花粉的萌发和花粉管的伸长机制不同[1]。

3结论

PTK激酶可能通过调节H2O2水平参与ABA诱导的气孔关闭。木黄酮和tyrphostin A23通过清除细胞内H2O2的方式不仅能抑制外源H2O2诱导的气孔关闭，还能逆转ABA诱导关闭的气孔重新开放。

参考文献：

[1]Zi H J， Xiang Y， Li M， et al. Reversible protein tyrosine phosphorylation affects pollen germination and pollen tube growth via the actin cytoskeleton[J]. Protoplasma，2007，230（3-4）：183-191.

[2]Yemets A， Sheremet Y， Vissenberg K， et al. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells[J]. Cell Biology International，2008，32（6）：630-637.

[3]Ghelis T， Bolbach G， Clodic G， et al. Protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases are involved in abscisic acid-dependent processes in Arabidopsis seeds and suspension cells[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1668-1680.

[4]McAinsh M R， Clayton H， Mansfield T A， et al. Changes in stomatal behavior and guard cell cytosolic free calcium in response to oxidative stress[J]. Plant Physiology，1996，111（4）：1031-1042.