刘卫卫，韩伟，黄国宁

(重庆市妇幼保健院 遗传与生殖研究所，重庆 400013)

人工卵母细胞激活在ICSI受精失败周期中的应用

刘卫卫，韩伟，黄国宁*

(重庆市妇幼保健院 遗传与生殖研究所，重庆 400013)

在辅助生殖技术领域，人工卵母细胞激活(AOA)是解决单精子卵胞浆内显微注射(ICSI)低受精或完全未受精周期中精子缺陷所致卵母细胞激活失败的重要措施。文献报道AOA的方法包括机械刺激、电刺激和化学激活。但与传统ICSI相比，ICSI 联合AOA(ICSI-AOA)对ICSI 受精失败周期的有效性和安全性尚难以评估。本文就AOA在ICSI受精失败周期中的应用，包括卵母细胞激活的机制、ICSI受精失败原因、AOA的方法和AOA的有效性及安全性进行综述，并探讨AOA 在临床应用中存在的问题，以期更好地服务于临床。

人工卵母细胞激活； 单精子卵胞浆内显微注射； 精子缺陷； 受精失败

In the field of assisted reproductive technology，artifical oocyte activation(AOA)is an important treatment method in ICSI cycle with previous low fertilization rate or total fertilization failure due to oocyte activation failure caused by sperm deficiency.Several methods of AOA including mechanical stimulation，electrical stimulation and chemical activation have been reported.However，it is difficult to assess the clinical efficacy and safety of ICSI with AOA compared with conventional ICSI in the couples of previous fertilization failure.The present article reviews the clinical practice of AOA in ICSI cycle with previous fertilization failure，the mechanism of oocyte activation，and the influent factors of ICSI fertilization failure，as well as AOA methods and the efficacy and safety of AOA，in order to explore the current problems of the clinical practice of AOA and better serve clinical application.

Keywords： Artificial oocyte activation； Intracytoplasmic sperm injection； Sperm deficiency； Fertilization failure

(JReprodMed2017，26(10)：1052-1056)

单精子卵胞浆内显微注射(ICSI)是解决男性不育的主要手段。自1992年第一例ICSI活胎分娩婴儿出生以来，该技术得到广泛的临床应用，使体外受精率提高到70%～80%[1-2]，但仍有1%～5%的完全或接近完全受精失败[3-4]。导致ICSI受精失败的原因很多，多数学者认为ICSI后受精失败很大程度上归因于卵母细胞激活失败[5]。目前对ICSI 受精失败的病例多采用人工卵母细胞激活(AOA)的方法。本文就AOA在ICSI受精失败周期中的应用，包括卵母细胞激活的机制、ICSI受精失败原因、AOA的方法和AOA的有效性及安全性，做一综述。并探讨AOA 应用存在的问题，以期更好地服务于临床。

一、卵母细胞激活的机制

卵母细胞激活由精子诱导的Ca2+振荡启动，并伴随许多有序的生物学事件，其功能是阻止多精受精、诱发精子进入胞质后的雄原核转化过程，促使卵母细胞脱离MII期阻滞，启动卵母细胞进入分裂后期，继而开始细胞周期有丝分裂，触发合子基因组激活和胚胎发育事件。有学者研究发现，精子进入卵母细胞与卵黄膜融合后数分钟Ca2+从内质网储存库释放入细胞内，引起细胞内Ca2+浓度的短暂升高，继而，Ca2+振荡持续存在于受精的整个过程，并随着受精过程的进行振荡幅度和频率逐渐降低，直至原核形成时终止，表明Ca2+是诱发细胞核质变化、受精和胚胎启动的必要因素[2，5-6]。动物实验模型显示正常的卵母细胞激活和胚胎发育不仅取决于细胞内早期短暂的Ca2+浓度升高的扳机作用，很大程度上还取决于后续Ca2+振荡的数量、频率、幅度和持续时间的交互作用[7]。卵母细胞激活涉及两步机制，即通过Ca2+振荡功能启动和维持细胞活化。第一步始于精卵质膜融合点，为精子诱导的卵浆游离钙浓度增加所必需的，然后呈波状式蔓延整个卵母细胞。第二步以短暂Ca2+振荡为特点，继而改变卵母细胞内部钙储存的功能型参数并支持后续一系列的Ca2+振荡[8]。这种在卵母细胞激活阶段的Ca2+振荡特殊类型可能对后续胚胎发育产生长远效应，如基因表达、甲基化状态等[9-10]。可见，Ca2+振荡在卵母细胞激活和胚胎发育过程具有非常关键的作用。

卵母细胞激活过程是一个多因素参与的复杂过程。从卵母细胞角度来看，不能对精子诱导的激活产生反应和不能将精子核去浓缩形成雄原核，均被称为卵母细胞激活失败，且激活失败的原因包括精子因素和卵母细胞因素。文献报道显示精子核膜周围的精子特异性磷脂酶C-zeta(PLC-z)缺陷可导致卵母细胞激活失败[11-13]。精卵融合与精子PLC-z进入卵母细胞有关，PLC-z可催化1，4，5三磷酸肌醇(IP3)的合成，而IP3是Ca2+从内质网释放的直接调节器。因此，精子PLC-z是诱导细胞内Ca2+振荡的重要因素。另外，卵母细胞线粒体功能异常或者卵母细胞核质的不完全成熟状态均可能导致卵母细胞激活缺陷[14-15]。

二、ICSI受精失败原因

自1997年Rybouchkin等[16]首次报道ICSI-AOA获得妊娠以来，越来越多的研究报道显示，对前次常规ICSI未受精或低受精的患者可以采用ICSI-AOA治疗[4]。但多数报道缺乏ICSI未受精或低受精的原因分析和诊断。在临床治疗和管理中，判定是精子因素还是卵母细胞因素导致的卵母细胞激活失败是非常重要的。并不是所有的ICSI受精失败周期都能够通过AOA获益，据报道存在精子相关激活缺陷的这部分周期可能从AOA中获得“补救”[17]。鼠卵激活实验(MOAT)(异质性ICSI，即将人的精子注射到小鼠的卵母细胞中)是ICSI受精失败周期的一种诊断方法[18]。根据MOAT可以初步诊断ICSI受精失败的原因，若激活率≤20%，可诊断为精子因素导致激活失败；若激活率≥85%，可排除精子因素导致的激活失败；若激活率介于两者之间，可诊断为存在精子因素和其他不明确的因素。Heindryckx等[18]报道AOA能够改善精子因素导致ICSI受精失败周期的临床结局。因此，精子因素引起的卵母细胞激活失败，可能是ICSI受精失败实施AOA的主要指征。对前次ICSI受精失败的周期，再次助孕前进行MOAT探求卵母细胞激活失败的原因是必要的。但有一点需要考虑，在应用MAOT的结果时，不能简单地认为对小鼠卵母细胞的激活率等同于对人类卵母细胞的激活率。

由于MAOT实验受到伦理和法律的限制，以及鼠卵在胚胎实验室使用的不方便性，寻求一种简便有效的诊断方法显得尤为重要。大量证据显示卵母细胞激活失败可能是精子核膜周围的精子特异性PLC-z缺陷导致。因此，采用特异性基因测序方法靶向检测精子PLC-z编码区域，并结合对精子标本的免疫荧光和免疫印迹检测，可能为这类患者提供一种有效的诊断方法，同时，这种明确的精子因素导致的卵母细胞激活失败，亦使重组PLC-z蛋白成为一种潜在的治疗试剂[5，19]。

卵母细胞自身状态在卵母细胞激活机制中同样发挥着重要的作用[2，14-15，20]。卵母细胞核和细胞质的不成熟状态可能抑制卵母细胞对精子PLC-z激活的反应，随着卵母细胞逐步成熟至MII状态，其对激活的反应能力逐步增强。另外一些不常见的原因，比如精子DNA去凝集的缺陷、卵母细胞纺锤体的缺陷、卵母细胞质量的降低、原核形成的异常和操作技术因素等[20]，亦可能导致卵母细胞的激活失败。因此，对ICSI受精失败周期的原因分析是极其复杂而又十分必要的。

三、AOA的方法

目前，在辅助生殖领域采用的AOA方法，与卵母细胞正常激活有所不同，多是人工诱导单一的Ca2+升高而无后续持续的Ca2+振荡，即仅仅人工诱导Ca2+升高来启动卵母细胞激活过程。AOA的方法主要有三种：机械激活、电激活和化学激活。

1.机械激活：在ICSI操作过程中，采用显微注射针抽吸卵母细胞靠近胞膜的胞浆，然后将抽吸的胞浆连同精子一起注入卵母细胞中央，这种方法即AOA机械激活。Ebner等[21]研究报道，对前次ICSI受精失败的患者再次助孕采用ICSI-AOA机械激活，可获得满意的受精率和临床妊娠率，并提示采用这种激活方法的目的是聚集胞膜周围胞浆富含的线粒体，因卵浆周围区域的线粒体具有相对较高的膜电位和ATP代谢活性，可增加后续原核形成位点的能源。同时强调这种激活方法可能对某些卵母细胞相关因素所致卵母细胞激活失败周期有效，在ICSI周期中常规使用这种方法并不能改善助孕结局。

2.电激活：外源性直流电引起卵母细胞膜蛋白的重排而形成胞膜孔道，细胞外的Ca2+通过孔道内流进入胞浆，诱发细胞内Ca2+浓度升高，这种方法即AOA电激活。Zhang等[22]报道，对常规ICSI后24 h受精失败的卵母细胞随机分三组：1)单次直流电脉冲刺激(1.36 kV/cm～1.50 kV/cm 维持40～60 μs)；2)三次直流电脉冲，每次时间间隔15～20 min；3)对照组(无电脉冲)，研究提示实施电刺激组(组1和组2)可以获得正常受精和胚胎早期发育，且胞浆的激活程度与电脉冲的数量密切相关。Baltaci等[23]将仅一次常规ICSI助孕完全受精失败患者的卵母细胞再次助孕时随机分为两组：(1)压力电脉冲组(单次直流电脉冲，1.50 kV/cm 维持100 μs)；(2)对照组(无压力电脉冲刺激)，研究发现压力电脉冲刺激可显著提高这部分患者卵母细胞的受精率和胚胎质量。但是，出于对电激活操作的复杂性和安全性的考虑，目前，采用电激活进行AOA的研究报道越来越少见。

3.化学激活：化学激活是ICSI受精失败周期中最常用的AOA方法。其中，最常用的化学试剂是钙离子载体，比如卡西霉素(A23187)和离子霉素。钙离子载体是一种脂溶性的分子，能够通过卵母细胞膜转运Ca2+，从而使细胞内Ca2+浓度一过性升高。研究报道钙离子载体的激活方法如下：常规ICSI后30 min，将卵母细胞置于钙离子载体中(终浓度10 μmol/L，置于胚胎培养箱10 min，15 min或者30 min)激活[17，24-29]。有时，在ICSI操作中连同注射精子一起注射少量CaCl2，然后将ICSI后的卵母细胞置于钙离子载体中激活[16]。氯化锶(SrCl2)也是AOA经常采用的化学激活试剂，该激活剂的特点与钙离子载体有所不同，其诱发卵母细胞内Ca2+振荡的确切机制尚不明确。研究报道氯化锶的激活方法如下：常规ICSI后30 min，将卵母细胞置于SrCl2中(终浓度10 μmol/L，置于胚胎培养箱60 min)激活[30-31]。以上几种化学激活方法是文献报道中最为常见的，除此之外，还有其他化学激活剂和激活方法的报道，比如，Liu等[32]报道采用7%无水乙醇作为激活剂，对体外培养成熟后ICSI的卵母细胞激活 6 min，指出这种激活方法可能对体外成熟卵母细胞的胚胎早期发育有益。

四、AOA的有效性和安全性

AOA最早应用于圆头精子症患者。圆头精子通常含有圆形或者形态异常的精子核，这种精子核内常伴有大片区域的空泡且多伴有异常形态的中段和尾部。因这种精子的顶体蛋白酶活性缺乏或减少而导致卵母细胞激活障碍，进而致使ICSI未受精或者低受精[33]。文献报道圆头精子症患者可以通过ICSI-AOA获得妊娠[34]。另外，光学显微镜检查精子和卵母细胞正常，大约1%～5%的患者ICSI出现未受精或低受精的结局。Chi等[35]对1例精液分析正常但ICSI助孕受精率低的男性患者的精子进行超微结构和蛋白表达研究，发现精子核多空泡和蛋白表达异常可能是ICSI 受精率低的主要原因。Montag等[26]报道采用ICSI-AOA可以显著提高前次ICSI周期受精率低于30%的患者的受精率和临床妊娠率。Sfontouris等[4]报道的系统评价显示ICSI-AOA可以提高某些未受精或低受精患者ICSI助孕的受精率和胚胎质量，但该系统评价中所纳入的文献多是个案报道，缺乏大样本数据的文献报道，而且缺乏ICSI-AOA与传统ICSI出生儿对照研究。

ICSI-AOA的安全性一直是临床胚胎工作者备受关注的问题。Kyono等[31]对前次ICSI受精失败的9例患者再次ICSI采用氯化锶(SrCl2)激活，报道5个健康儿出生。Takisawa等[36]报道通过钙离子载体A23187或氯化锶(SrCl2)激活获得的10个出生儿的生长和健康参数与常规ICSI获得的出生儿无明显差异。Yoon等[27]回顾性分析185例前次ICSI完全未受精或低受精的患者，再次ICSI后采用钙离子载体A23187化学激活，指出该激活方法可以提高不同精子来源(正常精子、少弱畸形精子和睾丸精子)患者的受精率和助孕结局，且经过ICSI-AOA获得的38个出生儿无出生缺陷发生。Vanden Meerschaut等[37]对21个通过ICSI-AOA获得的3～10岁儿童的神经系统发育进行评估，包括智力、语言和社会交际等参数，认为ICSI-AOA获得的孩子的这些参数均在正常范围。最近Miller等[28]发表的一篇连续8年的较大样本量的关于ICSI-AOA出生缺陷的回顾性研究，指出前次ICSI低受精患者实施钙离子载体(ICSI-AOA)激活与实施常规ICSI助孕的出生缺陷比率及类型，在单胎分娩和双胎分娩中均未增加。

五、小结

ICSI-AOA周期妊娠和分娩报道极其有限，AOA对ICSI受精失败周期是否有效和安全尚缺乏足够的证据。患者纳入条件和AOA方法的不同，使得文献报道的数据难以汇总。尽管这种“补救”的方式在某些临床情况可能适用，现有文献亦无实施ICSI-AOA增加助孕结局不利方面的报道，但是ICSI-AOA对卵母细胞增加的外界操作和刺激使卵母细胞质量发生的巨大变化及其对安全性的影响是不可忽视的。因此，这种“补救”的方法，在患者充分知情的情况下，仍应该谨慎采用。

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[编辑：辛玲]

ClinicalapplicationofartificialoocyteactivationinICSIcycleswithpreviousfertilizationfailure

LIUWei-wei，HANWei，HUANGGuo-ning*

ChongqingReproductiveandGeneticsInstitute，ChongqingObstetricsandGynecologyHospital，Chongqing400013

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.10.019

2017-04-07；

2017-05-05

重庆市卫生局医学科研项目(20142102)

刘卫卫，女，河南商丘人，助理研究员，生殖医学专业.(*

，Email：gnhuang217@sina.com)