王桂清，马 迪

(聊城大学 农学院，山东 聊城 252059)

5种不同镰刀菌的酶学特性分析

王桂清，马 迪

(聊城大学 农学院，山东 聊城 252059)

采用比色法和电泳技术对引起成年国槐根茎腐烂病的5 种镰刀菌的酶学特性进行了分析，为镰刀菌的分类和生理分化研究等提供理论依据。结果表明，5 种镰刀菌的可溶性蛋白含量及4种保护酶(EST、SOD、PPO和POD)活性的测定结果与电泳结果相一致，如5种镰刀菌的SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，电泳图谱清晰，谱带颜色较深、较明亮，说明电泳法可半定量地确定保护酶活性的大小；供试的5种镰刀菌在可溶性蛋白和EST、SOD、PPO等同工酶水平上存在差异，不同镰刀菌之间某些同工酶谱带数和同一迁移率谱带的亮度和色泽差异非常明显，既存在共同谱带又有特异性谱带，如5种镰刀菌EST同工酶图谱的共同谱带占23.5%，特异性谱带占76.5%，说明5种供试病原菌均属于镰刀菌属，但分属于不同的镰刀菌种。

镰刀菌； 酶学； 可溶性蛋白； 同工酶； 酶活性

国槐(SophorajaponicaLinn.)是我国特有树种，也是目前我国园林绿化的主要树种之一。近年，国槐根茎腐烂病在山东聊城地区发病较重，导致成年国槐树势衰弱甚至死亡，严重影响了城市绿化和园林建设。聊城大学国槐衰弱原因研究小组前期研究证明，镰刀菌(Fusariumsp.)是引起国槐根茎腐烂病的重要致病菌之一。

镰刀菌是重要的植物病害致病菌，由于其种类多、变异性强，对其分类、防治等均比较困难。镰刀菌作为一种生物，由细胞构成，每个细胞又由于酶的存在表现出种种生命活动，确保其新陈代谢正常进行。镰刀菌体内酶越多、越完整，酶活性越高，其生命越健康，适应性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等越强。同工酶是催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质等各不相同的一类酶，其分子构型的相似性可反映出生物种群间的亲缘关系，表现出明显的种属、组织和发育阶段的特异性，可为种和种以下分类提供理论依据[1-2]。本试验以引起国槐根茎腐烂病的5种镰刀菌为靶标，采用分光光度技术和同工酶技术，从酶学角度研究不同镰刀菌的差异，为镰刀菌的分类和生理分化研究、国槐根茎腐烂病的防治及相关研究等提供有力的理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌及培养

供试病原菌为从国槐根茎腐烂病发病部位分离得到的5种镰刀菌：多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、层生镰刀菌(F.proliferatum)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、F.keratoplasticum和腐皮镰刀菌(F.solani)，由聊城大学植物病理学研究室提供。利用PDA培养基于(25±1) ℃光照恒温培养箱培养5 d，备用。

1.2 酶蛋白的提取

用直径7 mm的打孔器自菌落边缘打取菌片，接种于PA培养液(250 mL三角瓶中装有培养液100 mL)中，每瓶15个菌片，于(25±1)℃、150 r/min振荡培养箱中培养6 d。真空抽滤，剔除菌片，获取菌丝，滤纸压干。按王桂清等[3]的方法提取酶蛋白。

1.3 蛋白质含量的测定

参照周先婉等[4]的考马斯亮蓝G-250染色法进行蛋白质含量测定，以白蛋白为标准蛋白制作标准曲线。准确吸取3倍稀释的样品0.1 mL，加入3 mL考马斯亮蓝G-250试剂，混合均匀后放置2 min。在595 nm波长下测定OD值，在标准蛋白曲线上查得被测样品的蛋白质含量。

1.4 保护酶活性测定

酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性测定参照王桂清等[5]、姬兰柱等[6]的方法，多酚氧化酶(PPO)活性的测定参照肖婷等[7]的方法。

1.5 蛋白质及同工酶电泳凝胶染色

参照胡能书等[8]的方法制胶并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离。分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为3%；浓缩胶内电泳电压为80 V，分离胶内电泳电压为90 V。可溶性蛋白及同工酶凝胶染色方法参照王桂清等[3]的方法。

1.6 电泳图谱的聚类分析

电泳后测量凝胶图谱各谱带的泳动距离，计算每条谱带的迁移率(Rf)。将电泳获得的每一条谱带的有无作为统计参数，采用有酶带记为“1”、无酶带记为“0”的方法，得到电泳的“0、1”矩阵。

Rf的计算公式如下：

Rf=固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离/固定染色后指示剂的迁移距离。

2 结果与分析

2.1 不同镰刀菌可溶性蛋白含量及保护酶活性比较

5种镰刀菌的可溶性蛋白含量差异显著，多隔镰刀菌的含量最高，为0.031 8 mg/mL，木贼镰刀菌的含量最低，为0.008 9 mg/mL，前者是后者的3.57倍；腐皮镰刀菌、层生镰刀菌和F.keratoplasticum的含量依次为0.025 2 mg/mL、0.013 6 mg/mL和0.011 9 mg/mL，后两者的可溶性蛋白含量比较接近，差异不显著(图1)。

标注不同字母代表差异显著(P<0.05),下同图1 不同镰刀菌的可溶性蛋白含量

多隔镰刀菌、层生镰刀菌、木贼镰刀菌、F.keratoplasticum和腐皮镰刀菌5种镰刀菌的SOD活性依次为5 119.99 U/mg、2 263.09 U/mg、3 219.20 U/mg、5 182.41 U/mg和6 134.42 U/mg，除多隔镰刀菌和F.keratoplasticum差异不显著外，其余菌之间均差异显著，其中，腐皮镰刀菌的SOD活性最高，层生镰刀菌的最低，前者是后者的2.71倍(图2)。

供试的5种镰刀菌的EST活性均很高且差异显著。其中，多隔镰刀菌的EST活性最高，为80 109.01 U/mg，木贼镰刀菌的活性最低，为44 224.72 U/mg，前者是后者的1.81倍；层生镰刀菌和腐皮镰刀菌的EST活性均为75 000 U/mg左右，差异不显著；F.keratoplasticum的EST活性为58 571.43 U/mg，相对较低(图3)。

图2 不同镰刀菌的SOD活性

图3 不同镰刀菌的EST活性

与SOD和EST 2种酶的活性比较，供试镰刀菌的PPO活性整体水平较低。不同镰刀菌间PPO活性差异显著，其中，层生镰刀菌的PPO活性最高，为191.18 U/mg，F.keratoplasticum的活性最低，为82.77 U/mg，前者是后者的2.31倍(图4)。

供试5种镰刀菌的POD活性远远低于SOD、EST和PPO的活性，变化幅度为0.77～2.58 U/mg。菌种间POD活性存在差异，其中，多隔镰刀菌的活性最高，层生镰刀菌的活性最低，前者是后者的3.34倍(图5)。

图4 不同镰刀菌的PPO活性

图5 不同镰刀菌的POD活性

2.2 不同镰刀菌的同工酶图谱分析

供试5种镰刀菌的可溶性蛋白和同工酶电泳图谱见图6，根据图谱统计出的电泳谱带数量见表1。图6和表1表明，5种镰刀菌在可溶性蛋白和同工酶电泳图谱的谱带数量上存在一定的差异。

图谱从左到右依次为多隔镰刀菌、层生镰刀菌、木贼镰刀菌、F.keratoplasticum、腐皮镰刀菌图6 不同镰刀菌可溶性蛋白和同工酶电泳图谱表1 5种镰刀菌可溶性蛋白及同工酶电泳图谱分析结果

项目谱带编号Rf镰刀菌种类12345项目谱带编号Rf镰刀菌种类12345可溶性蛋白10.00510101EST10.0211100020.0111000020.0270100030.0271111130.0961111140.0331000140.1910001050.0381001150.2451000060.0431110160.2661000070.0541111170.2771111180.0651111180.33000011

续表1 5种镰刀菌可溶性蛋白及同工酶电泳图谱分析结果

注：镰刀菌1、2、3、4、5分别为多隔镰刀菌、层生镰刀菌、木贼镰刀菌、F.keratoplasticum、腐皮镰刀菌。

可溶性蛋白标记比较丰富，5 种镰刀菌共分离出了30 条谱带，其中，多隔镰刀菌的谱带最多，为25 条，其次为腐皮镰刀菌(23条)、木贼镰刀菌(15条)，层生镰刀菌和F.keratoplasticum均13 条。共同谱带有6 条，Rf值分别为0.027、0.054、0.065、0.087、0.130和0.913，占所有谱带的20%；特异性谱带有24 条，占所有谱带的80%。由此可见，在可溶性蛋白方面供试5 种镰刀菌间差异较大，生理分化明显。

EST电泳图谱共分离出了17条清晰且颜色比较深的谱带，其中，共同谱带有4 条，Rf值分别为0.096、0.277、0.383和0.511，占所有谱带的23.5%，特异性谱带有13条，占所有谱带的76.5%，是标记最丰富的同工酶图谱之一。不同菌株之间谱带数量差异较大，多隔镰刀菌的谱带最多，为11 条，木贼镰刀菌的谱带最少，为5条，谱带在凝胶的上、中、下各部位都有分布。

SOD同工酶电泳产生的条带数较少，共分离出了6 条清晰透明的谱带，每种镰刀菌的谱带数均在3～5 条，其中，共同谱带3 条，Rf值分别为0.333、0.417和0.479，占所有谱带的50%。

病菌PPO电泳图谱共分离出5 条谱带，无共同谱带，均为特异性谱带。POD电泳结果表明，5 种镰刀菌均没有POD同工酶谱带。

从电泳图谱(图2)还可以看出，不同镰刀菌的可溶性蛋白和同工酶谱带不仅数量上有差异，同时相同谱带的颜色和宽度也有差异，表明酶活性不同，酶带越宽、颜色越深，其酶活性越高。如EST，图谱中多隔镰刀菌和腐皮镰刀菌的谱带颜色最深、酶带最宽，两者的酶活性也最高，分别为80 109.01 U/mg和76 034.39 U/mg；再如POD，图谱中5种镰刀菌均无谱带，酶活性测定结果表明，五者的酶活性也均很低，均不高于2.58 U/mg。说明同工酶图谱与酶活性测定结果相一致。

3 结论与讨论

采用分光光度法和同工酶技术对引起成年国槐根茎腐烂病的5种镰刀菌的酶学特性进行了分析，结果表明，5 种镰刀菌之间可溶性蛋白含量及4 种保护酶(EST、SOD、PPO和POD)活性存在显著差异，其中，可溶性蛋白含量较低，EST和SOD的活性较高，SOD活性在2 263.09～6 134.42 U/mg，EST活性在44 224.72～80 109.01 U/mg，PPO活性较低，在82.77～191.18 U/mg，而POD的活性最低，在0.77～2.58 U/mg；5 种镰刀菌的可溶性蛋白和同工酶电泳图谱在谱带数量上存在差异，可溶性蛋白和EST的谱带数量多，而POD无同工酶谱带，同时不同菌在谱带颜色和宽度上也存在差异，电泳结果与酶活性测定结果相一致，说明用电泳法既可鉴定某种保护酶有无同工酶，也可根据凝胶上电泳分离的酶带的着色深浅与面积大小，半定量地确定该保护酶的活性大小。

可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，其积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。多隔镰刀菌和腐皮镰刀菌的可溶性蛋白含量相对较高，说明这2种镰刀菌的适应能力相对较强。

酶是生物体的组成成分，不断在体内新陈代谢，其催化作用包括正催化和负催化，活性受多方面的调控，以保障生命活动中的各种化学反应有条不紊、协调一致地进行。绝大多数酶为蛋白质，酶促反应需要温和的条件，高温、强酸、强碱、紫外线、有机溶剂、重金属盐、剧烈振荡等易使蛋白质变性的理化因素均可导致酶变性而失去催化活性。本研究所用靶标——5种镰刀菌，同一时间分离于国槐根茎腐烂部位，培养基及培养条件一致，继代次数相同，其酶蛋白提取和酶活性测定方法一致，酶活性调控因子和不利的理化因素不存在或系统误差可忽略不计。研究结果表明，供试的5 种镰刀菌在EST、SOD、PPO和POD等酶活性指标上均存在差异，说明5 种供试镰刀菌的适应性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等存在差异。

SOD在生物界的分布极广，是重要的抗氧化酶，是氧自由基的自然天敌，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，其在生物体内的水平高低意味着机体的抗氧化能力大小和衰老程度高低；SOD参与了生物体中几乎所有的对抗各种环境胁迫的生理生化反应，不良条件都会引起SOD活性的升高[9]。由SOD活性测定结果可以看出，5 种镰刀菌菌体内SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，电泳图谱清晰，谱带颜色较深、较明亮，其原因可能是，5种镰刀菌均来源于腐烂病发病严重的国槐茎和根，营养物质含量比较低，不能为病原菌提供适宜的水分、营养物质及盐分条件，病原菌处于逆境中，故SOD活性很高，以抵抗氧自由基对病原菌细胞造成的损害。至于具体是哪种或哪几种逆境条件导致病原菌的SOD活性升高，有待于进一步的研究。尤其是优势致病菌腐皮镰刀菌的SOD活性高于其他4 种致病菌，也说明了腐皮镰刀菌的致病性比较强。

PPO是广泛存在于植物、动物、真菌和细菌中的金属蛋白酶，在生物体酶促褐变、色素的合成等过程中起着关键的作用，能有效催化多酚类化合物氧化生成相应的醌类物质。真菌等微生物产生PPO，需要适宜的碳源、氮源、pH值、温湿度等环境条件。供试5种镰刀菌虽然均来源于成年国槐，但分离部位不同，且寄主植物发病的严重程度不同，故5种镰刀菌的PPO活性和同工酶图谱存在一定的差异。

POD具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的作用，供试菌株的POD活性较SOD、EST和PPO都低，说明供试镰刀菌体内过氧化氢、酚类及胺类物质的含量比较低，供试菌株所处的环境不利于病原菌POD的合成或者不利于POD底物的形成。

种间亲缘关系可以用同工酶酶谱相似度预判，相似性系数越大，酶谱差异越小，表明物种间亲缘关系越近[10]。EST常被用于物种的分类鉴定，EST同工酶图谱和形态特征一样，也是物种的基因型与环境效应相互作用的表现型之一，其差异反映了基因型的差异，显示出了物种间亲缘关系的远近[11]。本研究结果显示，供试5种镰刀菌的EST活性都比较高，同工酶图谱谱带数量多、颜色深，共同谱带占23.5%，表明5种供试病原菌均属于镰刀菌属；特异性谱带占76.5%，说明5种供试病原菌分属于不同的镰刀菌种。李萍等[12]采用电泳技术分别对安徽不同地区的46个辣椒疫霉进行EST同工酶分析发现，辣椒疫霉EST同工酶图谱与致病力相关。本研究在采样分离鉴定过程中发现，国槐根茎腐烂较严重，说明其病原菌或部分病原菌的致病性比较强，由于本试验没有进行致病性强弱的研究，故较高的EST活性和清晰的同工酶图谱是否与致病性有关还有待于进一步研究。

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Enzymatic Properties of Five DifferentFusariumSpecies

WANG Guiqing，MA Di

(College of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China)

The enzymatic analysis of fiveFusariumspecies causing root rot disease of adult Chinese scholar tree was carried out by colorimetry and electrophoresis,to provide a theoretical basis for classification and study on physiological differentiation ofFusarium.The results showed that the assay results of soluble protein content and enzymatic activity of four protective enzymes (EST,SOD,PPO and POD) were consistent with their electrophoresis results of the fiveFusariumspecies.For example,the SOD enzyme activities of fiveFusariumspecies were very high,in the range of 2 263.09—6 134.42 U/mg,meanwhile,their electrophoretic patterns were clear,and the color of the spectra was darker and brighter,which indicated that the activity of protective enzymes could be semi-quantitatively determined by electrophoresis.The results also showed that a significant diversity ofFusariumspecies was found in terms of spectrum change of soluble protein and isozyme including EST,SOD and PPO among those strains,and the obvious difference in the number of bands and brightness and color of bands with the same Rf value was also detected,so there were both common bands and specific bands.The common bands of EST isozyme patterns of fiveFusariumspecies accounted for 23.5%,and the specific bands accounted for 76.5%.This indicates that the five pathogens are all members of the genusFusarium,but respectively belong to differentFusariumspecies.

Fusariumsp.; enzymology; soluble protein; isozyme; enzymatic activity

2016-10-19

山东省自然科学基金项目(ZR2012CL17)；聊城市科技发展计划项目(2014GJH10)

王桂清(1968-)，女，河北泊头人，教授，博士，主要从事植物保护的教学与科研工作。 E-mail:wangguiqing@lcu.edu.cn

Q936

A

1004-3268(2017)04-0084-05