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补肾活血化痰方对多囊卵巢综合征模型大鼠的治疗作用机制研究Δ

2017-04-12王瑞杰王自闯河南中医药大学第二临床医学院郑州45000河南省中医院河南中医药大学第二附属医院生殖医学科郑州45000

中国药房 2017年7期
关键词:造模活血卵巢

王瑞杰,李 晖,王自闯(.河南中医药大学第二临床医学院,郑州 45000;.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院生殖医学科,郑州 45000)

补肾活血化痰方对多囊卵巢综合征模型大鼠的治疗作用机制研究Δ

王瑞杰1*,李 晖2,王自闯1(1.河南中医药大学第二临床医学院,郑州 450002;2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院生殖医学科,郑州 450002)

目的:考察补肾活血化痰方对多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠的治疗作用机制。方法:将50只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组[罗格列酮,3.0 mg/(kg·d)]和补肾活血化痰方高、低剂量组[7.5、5.0 g/(kg·d)],每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠均采用Poresky法复制PCOS模型。造模后,正常对照组和模型对照组大鼠ig生理盐水,各给药组大鼠ig相应药液,每天1次,连续22 d。给药结束后,测定大鼠血清中睾酮(T)、抗苗勒氏管激素(AMH)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平和卵巢组织中转化生长因子β1(TGF-β1)阳性表达情况。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平及卵巢组织中TGF-β1阳性表达率均显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,各给药组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平及卵巢组织中TGF-β1阳性表达率均显著降低(P<0.05),且补肾活血化痰方各剂量组指标优于阳性对照组(P<0.05)。结论:补肾活血化痰方能明显降低PCOS模型大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平以及卵巢组织中TGF-β1阳性表达率,这可能是其治疗PCOS的作用机制之一。

补肾活血化痰方;多囊卵巢综合征;抗苗勒氏管激素;胰岛素样生长因子;转化生长因子β1;肿瘤坏死因子α;大鼠

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种育龄妇女常见的内分泌及代谢异常性疾病,典型特征为高雄激素水平和卵巢长期无排卵。其发病机制复杂,与胰岛素抵抗、内分泌失调等多种因素均有关[1]。据报道,PCOS患者血清高雄激素水平的发生可能与抗苗勒氏管激素(AMH)紊乱有关[2]。另有研究认为,胰岛素抵抗与胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)有关[3],其中卵巢组织中IGF-Ⅰ功能与胰岛素类似,参与糖、脂等的代谢。转化生长因子β1(TGF-β1)具有抑制细胞生长、刺激细胞间质生成的双向作用,在卵泡发育过程中发挥着重要作用。

补肾活血化痰方为河南中医药大学第二附属医院褚玉霞教授总结临床经验而得的验方,由丹参、菟丝子、熟地黄等11种中药材组成,具有补肾益精、活血通络等功效,在临床上能有效提高PCOS患者的排卵率[4-5]。本研究中,作者拟以PCOS大鼠为模型动物,根据PCOS现代医学发病机制,探讨补肾活血化痰方对PCOS模型大鼠血清中AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α和卵巢组织中TGF-β1表达的影响,探讨其治疗PCOS的可能作用机制。

1 材料

1.1 仪器

Uniwersal 32R型高速冷冻离心机(美国Sigma公司);SZ61型光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 药品与试剂

补肾活血化痰方(河南省中医药大学第二临床医学院中药房自制,批号:002345;规格:每1 mL相当于生药1 g);罗格列酮片(太极集团涪陵制药有限公司,批号:041399,规格:4 mg/片);注射用人绒毛膜促性腺激素(HCG,上海第一生化药业有限公司,批号:030610);中性胰岛素注射液(江苏徐州万邦生化制药有限公司,批号:120536);睾酮(T)放射免疫检测试剂盒(北京东雅生物试剂公司,批号:FM0084);AMH酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国DSL有限公司,批号:EAI05038);IGF-ⅠELISA试剂盒(意大利Diasorin公司,批号:E0050h);TNF-α ELISA试剂盒(上海翔升生物科技有限公司,批号:EL10019);兔抗IGF-Ⅰ单克隆抗体、生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(美国Santa Cruz公司);TGF-β1免疫组化试剂盒(上海蓝基生物技术有限公司,批号:BA0290)。

1.3 动物

健康SD大鼠50只,♀,SPF级,体质量160~200 g,鼠龄54~60 d,购自河南省实验动物中心,许可证号为SCXK(豫)2010-0002。所有大鼠均在室温为18~22℃、湿度为55%~65%、压力梯度为20~50 kPa的环境中适应性饲养7 d后用于实验,饲养期间正常饮食。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

2.1.1 分组 将50只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和补肾活血化痰方高、低剂量组,每组10只。

2.1.2 造模 除正常对照组外,其余各组大鼠均采用Poresky法[6]复制PCOS动物模型。各造模组大鼠均sc HCG 1.5 U/d,每天2次,共22 d;并同时sc中性胰岛素(实验1~11 d,剂量从0.5 U/d开始逐渐增加到6.0 U/d,每天2次;从12 d开始剂量便维持在6.0 U/d,直到造模结束);期间以5%葡萄糖溶液作为日常饮水。正常对照组大鼠每天sc等容积注射用水,并ig等体积日常饮用水。造模的最后一天,所有大鼠禁食过夜,次日称体质量后测定血清中T水平并进行阴道涂片。若血清中T水平异常升高,阴道角化细胞持续出现或失去完整动情周期,则表明造模成功[7]。

2.1.3 给药 从造模成功后的第2天开始给药:正常对照组和模型对照组大鼠ig蒸馏水,阳性对照组大鼠ig罗格列酮3.0 mg/(kg·d)(根据成人临床用量的20倍剂量换算而得),补肾活血化痰方高、低剂量组大鼠分别ig补肾活血化痰方7.5、5.0 g/(kg·d)(根据成人临床用量的20、10倍剂量换算而得),每天1次,连续22 d。

2.2 标本采集

末次给药后大鼠禁食过夜,次日称体质量,眼眶后静脉丛取血,离心,分离血清,将血清置于-20℃冰箱中保存,备用。然后将大鼠断头处死,游离卵巢,置于4%多聚甲醛(4℃)中固定24 h,以卵巢最大平面为待检测面,常规石蜡包埋,制成4 μm切片,用于免疫组化检测。

2.3 指标检测

2.3.1 血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平 采用放射免疫法测定大鼠血清中T水平;采用ELISA法测定大鼠血清中AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平,严格按照各自试剂盒说明书操作。

2.3.2 卵巢组织中TGF-β1表达 采用免疫组织化学法。一抗采用兔抗TGF-β1单克隆抗体(稀释比例为1∶200);二抗采用生物素标记的羊抗兔IgG抗体(稀释比例为1∶200),孵育时间为1~2 h。二氨基联苯胺(DAB)显色,冲洗后苏木素复染,常规脱水、透明、干燥、封片,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照,对图片进行图像分析。光镜下选择5个视野,各视野计数100个间质细胞,计数阳性细胞百分比(细胞质内着色为淡黄色至棕黄色提示为阳性细胞)。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平测定结果

与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平均显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,各给药组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平均显著降低(P<0.05);与阳性对照组比较,补肾活血化痰方高、低剂量组大鼠上述指标降低更为明显(P<0.05);补肾活血化痰方高、低剂量组间比较,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平测定结果详见表1。

表1 各组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平测定结果(±s,n=10)Tab 1 The levels of T、AMH、IGF-Ⅰand TNF-α inserum of rats in each group(±s,n=10)

表1 各组大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平测定结果(±s,n=10)Tab 1 The levels of T、AMH、IGF-Ⅰand TNF-α inserum of rats in each group(±s,n=10)

注:与正常对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05;与阳性对照组比较,ΔP<0.05Note:vs.normal control group,*P<0.05;vs.model control group,#P<0.05;vs.positive control group,ΔP<0.05

TNF-α,pg/mL 14.07±2.2227.13±2.12*20.69±2.25#14.00±2.15#Δ15.06±2.02#Δ组别正常对照组模型对照组阳性对照组补肾活血化痰方高剂量组补肾活血化痰方低剂量组剂量,mg/(kg·d)3.0 7.5 5.0T,ng/dL 5.56±1.42 19.57±3.82*10.24±2.67#6.86±2.05#Δ7.35±1.90#ΔAMH,ng/mL 2.89±1.02 7.85±2.54*4.50±1.42#3.00±1.40#Δ3.18±1.38#ΔIGF-Ⅰ,ng/mL 0.30±0.170.49±0.06*0.40±0.09#0.31±0.06#Δ0.32±0.07#Δ

3.3 卵巢组织中TGF-β1阳性表达率测定结果

与正常对照组比较,模型对照组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,各给药组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率均显著降低(P<0.05);与阳性对照组比较,补肾活血化痰方高、低剂量组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率降低更为明显(P<0.05);补肾活血化痰方高、低剂量组间比较,TGF-β1阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率测定结果见表2。

表2 各组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率测定结果(±s,n=10)Tab 2 The positive expression rate of TGF-β1in ovarian tissue of rats in each group(±s,n=10)

表2 各组大鼠卵巢组织中TGF-β1阳性表达率测定结果(±s,n=10)Tab 2 The positive expression rate of TGF-β1in ovarian tissue of rats in each group(±s,n=10)

注:与正常对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05;与阳性对照组比较,ΔP<0.05Note:vs.normal control group,*P<0.05;vs.model control group,#P<0.05;vs.positive control group,ΔP<0.05

TGF-β1阳性表达率,%13.50±1.9542.56±6.15*30.28±5.24#20.14±3.67#Δ22.95±3.54#Δ组别正常对照组模型对照组阳性对照组补肾活血化痰方高剂量组补肾活血化痰方低剂量组剂量,mg/(kg·d)3.0 7.5 5.0

4 讨论

目前,PCOS动物模型建立的方法有孕激素+HCG法、雄激素法、胰岛素+HCG法(即Poresky法)等[6-7]。Poresky法造模后表现出无排卵、血清T水平显著上升的特点,病理组织学检查卵巢症状与临床表现类似,这是本研究选择Poresky法造模的原因之一。西医治疗PCOS主要以罗格列酮等抗胰岛素抵抗相关药物为主,能有效增强胰岛素敏感性、促进排卵。中医则认为PCOS的发生在于本虚标实,其中本虚即本肾虚,标实包括血瘀、痰湿等,这也为补肾活血化痰方治疗PCOS提供了理论基础。

报道称,50%~70%的PCOS患者伴有糖代谢异常现象,表现为胰岛素抵抗[7]。在本研究中,模型对照组大鼠血清中T水平明显高于正常对照组(P<0.05),提示造模成功。给药后,大鼠血清中T水平较模型对照组均显著下降,且补肾活血化痰方组下降幅度较阳性对照组更为明显。AMH在TGF-β家族中占据重要地位,其在直径小于4 mm的窦卵泡中表达最强,窦卵泡直径越大则表达越弱,可见AMH表达强弱与窦卵泡直径的有关,因此推断可将AMH作为PCOS诊断的重要指标之一[8]。IGF-Ⅰ含有70个氨基酸,其结构、功能类似胰岛素,具有调节细胞生长、参与机体新陈代谢等作用。当IGF-Ⅰ水平异常升高时,IGF-Ⅰ的类似胰岛素功能也随之变化,致使机体新陈代谢异常、雄激素水平上升,增加胰岛素抵抗,最终导致PCOS发生。TGF-β1参与卵泡的发育过程,有双向作用,一方面可抑制多种细胞生长,另一方面却可刺激细胞间质生成。TNF-α是重要的促炎细胞因子,且在PCOS合并胰岛素抵抗的患者中表达增高,推测其参与了PCOS的发病,是目前PCOS研究的热点[3]。本研究结果显示,补肾活血化痰方能有效调节PCOS模型大鼠卵巢组织中TGF-β1的异常高表达,降低血清中AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平,且作用强于罗格列酮。

《医学正传》中记载:“经水全赖肾水施化,肾水缺乏而经水日以干涸”[9]。中医认为肾虚为PCOS患者排卵障碍的根本原因,而肾虚也易导致痰瘀或血瘀发生,瘀不去则新不生[10]。补肾活血化痰方中的丹参活血化瘀;熟地黄滋阴补血、益精填髓;菟丝子补肾益精;仙灵脾补肾壮阳、祛风除湿;白术健脾益气;茯苓利水渗湿;川牛膝活血通络、祛风除湿;陈皮健脾燥湿;白芥子化痰理气;姜半夏化痰;香附理气调中、调经止痛。诸药合用,共奏补肾益精、活血通络、祛痰除湿之功效[11]。

综上所述,补肾活血化痰方可能是通过调节血清中AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平以及卵巢组织中TGF-β1阳性表达,从而降低PCOS模型大鼠血清中高水平雄激素和减轻胰岛素抵抗,这可能是其治疗PCOS的机制之一。

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Study on the Curative Mechanism of Bushen Huoxue Huatan Formula on Polycystic Ovarian Syndrome Model Rats

WANG Ruijie1,LI Hui2,WANG Zichuang1(1.The Second Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine,Zhengzhou 450002,China;2.Dept.of Reproductive Medicine,the Second Affiliated Hospital,Henan University of Chinese Medicine/Henan Traditional Chinese Medicine Hospital,Zhengzhou 450002,China)

OBJECTIVE:To detect curative mechanism of bushen huoxue huatan formula on polycystic ovarian syndrome(PCOS)model rats.METHODS:50 rats were randomly divided into normal control group,model control group,positive control group[rosiglitazone,3.0 mg/(kg·d)]and Bushen huoxue huatan formula high-dose,low-dose groups[7.5,5.0 g/(kg·d)],10 in each group.Except for normal control group,the PCOS model was induced by Poresky method in other groups.After modeling,normal control group and model control group were received normal saline intragastrically,medicine groups were received corresponding liquids intragastrically,once a day,for 22 d.After administration,the serum levels of testosterone(T),anti-mullerian hormone(AMH),insulin-like growth factorⅠ(IGF-Ⅰ),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and the positive expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)in ovarian tissue were determined.RESULTS:Compared with normal control group,T,AMH,IGF-Ⅰ,TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate in ovarian tissue of rats in model control group were significantly increased(P<0.05);compared with model control group,T,AMH,IGF-Ⅰ,TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate of rats in ovarian tissue in other medicine groups were significantly decreased(P<0.05),and the indexes in Bushen huoxue huatan formula different doses groups were superior to positive control group(P<0.05).CONCLUSIONS:Bushen huoxue huatan formula can obviously reduce the T,AMH,IGF-Ⅰ,TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate in ovarian tissue in model rats with PCOS,which may be one of the mechanisms of its treatment for PCOS.

Bushen huoxue huatan formula;Polycystic ovarian syndrome;Anti-mullerian hormone;Insulin-like growth factor;Transforming growth factor-β1;Tumor necrosis factor-α;Rats

R285.5

A

1001-0408(2017)07-0899-04

2016-06-07

2016-12-09)

(编辑:林 静)

河南省教育厅科学技术研究重点项目(No.13A360579);全国名老中医药专家传承工作室建设项目(No.〔2014〕-20号);河南中医学院博士启动基金(No.BSJJ2012-21)

*讲师,博士。研究方向:生殖内分泌、不孕不育。电话:0371-60908737。E-mail:wangruijie021@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.10

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