许丹妮++刘平平++苏宁++安全++赵丹++李萌++王昌涛

摘要：采用紫外分光光度法测定马齿苋（Portulaca oleracea L.）发酵液中总糖、黄酮、蛋白质的含量，分析了发酵液对DPPH自由基的清除效果，通过测定发酵液对B16细胞中酪氨酸酶活性的抑制效果评价发酵液的美白功效。结果表明，马齿苋发酵液中总糖、黄酮含量分别为3.90、0.59 mg/mL；蛋白质含量为55.72±0.83 μg/mL。发酵液对DPPH自由基的清除效果良好，对B16细胞中酪氨酸酶的活性有抑制作用。

关键词：马齿苋（Portulaca oleracea L.）；发酵液；活性成分；功效评价

中图分类号：Q949.745.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0924-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.033

Study on the Contents of Active Ingredients and Cosmetic Efficacy of Portulaca oleracea L. Fermentation Liquor

XU Dan-ni1，LIU Ping-ping1，SU Ning2，AN Quan3，ZHAO Dan1，LI Meng1，WANG Chang-tao1

（1.School of Science， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Cosmetic Center， Beijing 100176， China；3.Yunnan Baiyao Group Co.， Ltd.， Kunming 650500， China）

Abstract： Contents of main active ingredients and cosmetic efficacy of Portulaca oleracea L. fermentation liquor were studied. Measuring the contents of total sugars，flavonoids，and protein in the fermentation liquor of Portulaca oleracea L. by UV spectrophotometry. Experiments were operated on scavenging DPPH radicals in terms of measuring the antioxidant activity of fermentation liquor. Evaluating the whitening efficacy of fermentation liquor by determining the inhibition effect on tyrosinase activity in B16 cells. Results shows that the contents of total sugar，flavonoids and protein in the fermentation liquor of Portulaca oleracea L. were 3.90 mg/mL，0.59 mg/mL and 55.72±0.83 μg/mL. The fermentation liquor has good scavenging effects on DPPH radicals and can inhibit the activity of tyrosinase in B16 cells.

Key words： Portulaca oleracea L.； fermentation liquor； active ingredients； cosmetic efficacy evaluation

马齿苋（Portulaca oleracea L.）是马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，是菜药兼用植物，在中国大部分地区均有分布，又名长命菜、五行草、瓜子菜、麻绳菜、五色苋、马食菜等[1]。马齿苋具有清热解毒、凉血止血的功能，用于治疗热毒血痢、痈肿疗疮、湿疹、丹毒、痔血和崩漏下血等病症[2]。马齿苋中含有多种微量元素、黄酮、多糖、氨基酸、多酚、维生素、不饱和脂肪酸等生物活性成分，具有防治心脏病、冠心病、心绞痛、糖尿病、白癜风、白发病，抗癌、抗衰老、降血压、降低中风率等作用[3]。马齿苋还可起到保湿、美白、舒緩肌肤的作用[4]。微生物发酵可将有效成分分离、提取，使其更具生物活性，在发酵过程中还可能会伴随某些成分的分解转化而生成新的有效成分[5]。发酵法不失为一种更加高效环保的提取方法。本研究采用黄酒酵母发酵马齿苋，测定上清液中的活性成分含量并评价发酵液在化妆品方面的功效[6]，以期对马齿苋的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器 高压灭菌锅，上海申安医疗机械厂；全温度振荡培养箱，太仓华美生化仪器厂；UVmini-1240型紫外可见分光光度计，日本岛津有限公司；低速大容量台式离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司；pH计，美国优特公司；GSY-G1型固含物测量仪，深圳芬析仪器制造有限公司。

1.1.2 试剂 马齿苋干品，北京同仁堂集团公司；黄酒酵母，北京市食品酿造研究所；DPPH，分析纯，Sigma公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硫酸、苯酚、氢氧化钠、硝酸铝、水杨酸、福林酚、FeSO4、H2O2、过硫酸钾等试剂均为国产分析纯；小鼠黑素瘤细胞（B16），中国科学院细胞库；DMEM，美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 马齿苋发酵液制备 称取一定量马齿苋粉末，按照1∶20的料液比（m∶V）加入去离子水，于121 ℃高压灭菌25 min，冷却后接入5%的黄酒酵母菌液，于28 ℃、180 r/min的空气摇床中培养48 h，然后4 800 r/min离心20 min，上清液即为马齿苋发酵液。

1.2.2 马齿苋发酵液理化指标测定 分别用pH计和固含物测量仪对马齿苋发酵液的pH以及可溶性固形物含量进行测定。

1.2.3 马齿苋发酵液中主要活性成分含量的测定 发酵液中总糖含量的测定参考文献[7]，总黄酮含量的测定采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色法[8]，蛋白质含量的测定参考文献[9]。

1.2.4 马齿苋发酵液对DPPH自由基的清除作用 取等体积的样品液与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A样品），取等体积的去离子水与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A空白），取等体积的去离子水与样品液混匀（A对照），反应30 min后，在517 nm下测 A样品、A空白、A对照吸光度。发酵液对DPPH清除率计算公式为清除率=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%。

1.2.5 马齿苋发酵液对B16细胞中酪氨酸酶活性抑制试验 选择对数生长期状态良好的B16细胞，胰酶消化后计数，接种于6孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜；更换培养基，加入供试品及对照品，以未处理的细胞作为阴性对照组，37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h；将培养板置于冰上，培养基弃掉，加入PBS洗涤1次；加入裂解液，细胞刮刀刮取细胞，收集至离心管中；4 ℃离心20 min，吸取上清液；取50 μL细胞上清液至96孔板，再加入50 μL 1%左旋多巴，37 ℃孵育1 h；于M3读板仪上475 nm处读取吸光度。酪氨酸酶活性变化=[（A测定-A空白）/（A对照-A空白）]×100[10]。

2 结果与分析

2.1 马齿苋发酵液理化指标

马齿苋发酵液为淡黄色液体，测得发酵液的pH为5.61，偏酸性，与人类皮肤的酸碱度相近，适宜作为化妆品原料。发酵液中可溶性固形物含量为5.11%，可进一步测定发酵液中可溶性化合物的含量。

2.2 马齿苋发酵液中主要活性成分的含量

以葡萄糖的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，得到回归方程为y=0.015 1x+0.004 2，R2=0.999 6，将发酵液测得的吸光度代入标准曲线得到总糖浓度为3.90 mg/mL。从芦丁标准曲线得到回归方程y=1.971 5x+0.001 06，R2=0.999 4，由此计算得出发酵液中黄酮含量为0.59 mg/mL。对吸光度和牛血清蛋白浓度进行线性回归处理，回归方程为y=0.001 4x+0.031 3，R2=0.999 1，将样品吸光度代入方程计算出蛋白质浓度为55.72 μg/mL。马齿苋发酵液中总糖含量最高，其次为黄酮和蛋白质。在化妆品中，多糖可起到抗皱保湿的效果；黄酮类物质可清除多余的自由基，发挥抗氧化活性；蛋白质是组成人体细胞、组织的重要成分，可保持皮肤弹性润泽。

2.3 马齿苋发酵液对DPPH自由基的清除作用

圖1为马齿苋发酵液和水提液对DPPH自由基的清除效果。从图1可以看出，当浓度在5%以内时发酵液和水提液对DPPH自由基的清除率均呈现出良好的量效关系；当浓度大于5%时，两种提取液对DPPH自由基的清除率趋于平缓。清除50%的DPPH自由基需要1.89%的发酵液或2.46%的水提液，20%的发酵液和水提液对DPPH自由基的清除率分别为90.12%和80.68%，马齿苋发酵液对DPPH自由基的清除活性大于水提液。

2.4 马齿苋发酵液对B16细胞中酪氨酸酶活性的影响

皮肤中黑色素的合成是一个多步骤的酶促生化反应，受到复杂而精细的调控，其中酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，该酶催化黑素合成的早期限速反应[11]。图2为不添加马齿苋发酵液和添加了1%的马齿苋发酵液对B16细胞中酪氨酸酶活性的影响，可以看出，使用马齿苋发酵液的B16细胞中酪氨酸酶活性明显降低。因此，马齿苋发酵液可以通过抑制黑色素合成过程中所需要的酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的合成，从而起到美白作用。

3 小结

马齿苋中含有多种对人类有益的活性成分，经过黄酒酵母发酵，得到的上清液中总糖、黄酮含量分别为3.90、0.59 mg/mL，多糖含量为55.72 μg/mL，经过进一步提取分离纯化可得到这些成分，发酵液提取与有机溶剂提取法相比更加环保和方便。微生物发酵法近年来很受欢迎，有益菌不仅可以提取出活性成分，还可以将这些成分变成小分子更有利于人体吸收[12]，具有广阔的市场前景。

同时，发酵液对DPPH自由基有良好的清除效果，当发酵液添加量大于5%时对DPPH自由基的清除率在90%以上，明显优于水提液，表明马齿苋发酵液具有良好的体外抗氧化活性。通过细胞试验证明了马齿苋发酵液可以通过抑制酪氨酸酶活性的途径来抑制细胞中黑色素的合成，进而发挥皮肤美白作用。

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