周美君++杨绍斌

摘要：为研究复合菌剂的除臭机理，将放线菌5406（Actinobacillus）、枯草芽孢杆菌B-903（Bacillus subtilis）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、钾细菌（Bacillus mucilaginosus）、植物乳桿菌Z3-1（Lactobacillus plantarum）和毕赤酵母（Pichia pastoris）按不同比例配制成复合菌剂，将其均匀喷洒到鸡粪表面并搅拌均匀，进行鸡粪堆肥对比试验，分别筛选出对甲基吲哚、硫化氢、氨气去除效果最好的除臭菌剂配方，并在已筛选出的配方中添加生物炭及化学试剂，检测除臭效果。结果表明，去除甲基吲哚效果最好的除臭菌剂配方为C4组（放线菌5406、枯草芽孢杆菌B-903、卷枝毛霉、钾细菌、植物乳杆菌Z3-1和毕赤酵母各25 mL，生物炭11 g，甲醇0.04 mg）；去除氨气效果最好的除臭菌剂配方为D3组（放线菌5406、枯草芽孢杆菌B-903、卷枝毛霉、钾细菌、植物乳杆菌Z3-1和毕赤酵母各20 mL，二价铁离子和抗坏血酸各0.06 g）；去除硫化氢效果最好的除臭菌剂配方为E4组（放线菌5406、枯草芽孢杆菌B-903、卷枝毛霉、钾细菌、植物乳杆菌Z3-1和毕赤酵母各20 mL，氧化锌0.08 mg）。

关键词：除臭菌剂；家禽粪便；发酵；堆肥；氨态氮

中图分类号：S141.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5789-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.016

Application of Complex Microbial Deodorization of Poultry Manure

ZHOU Mei-jun， YANG Shao-bin

（College of Life Science and Bioengineering， Shenyang University， Shenyang 110044， China）

Abstract：For the deodorization mechanism of composite microbial agent，Actinobacillus 5406，Bacillus subtilis B-903，Mucor circinelloides，Bacillus mucilaginosus，Lactobacillus plantarum Z3-1 and Pichia pastoris were prepared according to different proportion composite agents and evenly sprayed to the surface of chicken manure and stirred. Chicken manure compost contrast test were screened on methyl indole，hydrogen sulfide，ammonia removal deoderizer formula， and biochar and chemical reagents were added in the screened formula，and the deodorization effect was detected. The results showed that the best deoderizer formula of removing methylindole was C4 group（Actinobacillus 5406，Bacillus subtilis B-903，Mucor circinelloides，Bacillus mucilaginosus，Lactobacillus plantarum Z3-1 and Pichia pastoris 25 mL each，biochar 11 g，methanol 0.04 mg）； the best deoderizer formula of removing ammonia was D3 group（Actinobacillus 5406，Bacillus subtilis B-903，Mucor circinelloides，Bacillus mucilaginosus，Lactobacillus plantarum Z3-1 and Pichia pastoris 20 mL each， divalent iron ion and ascorbic acid 0.06 g）；the best deoderizer formula of removing hydrogen sulfide was E4 group（Actinobacillus 5406，Bacillus subtilis B-903，Mucor circinelloides，Bacillus mucilaginosus，Lactobacillus plantarum Z3-1 and Pichia pastoris 20 mL each，zinc oxide 0.08 mg）.

Key words： deodorizing microorganism； poultry manure； fermentation； compost； ammonia nitrogen

畜禽养殖场规模化、集约化的发展已使畜禽粪便的环境污染问题变得更加突出，堆肥处理是畜禽粪便资源化、减量化、无害化利用的一种有效途径。养鸡过程中产生大量的鸡粪、废水、死亡鸡等废弃物，如处理不当，将对环境造成严重污染，并影响生态畜牧业的发展。传统方法是通过加入除臭剂进行堆制发酵，使畜禽粪便腐熟从而消除这些污染。除臭菌剂含有放线菌、卷枝毛霉、硒钾细菌和一些活化因子，主要是除去硫化氢、氨气等恶臭气体，基本可以达到除臭杀菌的目的，但是有不足之处。如：①微生物种类单一，只能除去硫化氢、氨气等恶臭气体，但不能有效解决粪肥中的臭味源头。②无法保证鸡粪中的氮含量。③菌剂制作耗费成本大，保存时间短，除臭耗时较长。④菌与菌之间基本无协同作用。

本研究针对以上缺点研制出一种生物除臭菌剂，此菌剂将多种益生菌复配混合，能有效地将家禽粪便中恶臭成分溶解，还避免了氨气、硫化氢和甲基吲哚等有臭味气体的释放，并且臭气进入微生物细胞后，在微生物体内作为营养物质被其所分解、利用[1，2]，从根源上除去家禽粪便的恶臭。此除臭菌剂的净化效率高，对处理的恶臭气体要求较低，处理成本低廉，投资运行费用低，无二次污染，易管理，对人体和动植物无任何毒副作用，应用前景广阔。

1 材料和方法

1.1 材料

放线菌5406（Actinobacillus）、枯草芽孢杆菌B-903（Bacillus subtilis）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、钾细菌（Bacillus mucilaginosus）、植物乳杆菌Z3-1（Lactobacillus plantarum）和毕赤酵母（Pichia pastoris）由中国科学院微生物研究所提供，于沈阳大学重点实验室低温保存。对以上6种菌种分别活化，并通过摇床培养进行扩繁。

肉食鸡粪便由沈阳市辽中县彰驿养鸡场提供。对鸡粪进行预处理：向鸡粪中喷洒EM露，转化、吸收NH3、H2S、甲基吲哚等有臭味的气体，待拌匀后培堆静置3～6 h。

硫酸吸收液、水杨酸-酒石酸钾溶液、亚硝基铁氰化钠溶液、次氯酸钠溶液、吸收液、对氨基二甲基苯胺溶液、三氯化铁溶液、混合显色液、磷酸氢二铵溶液、碘酸钾标准溶液、5 g/L淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液、0.01 mol/L硫代硫酸钠标准溶液、0.01 mol/L碘溶液、盐酸溶液、硫化钠标准溶液均由沈阳大学重点实验室配制。

发酵袋选用聚乙烯塑料袋，规格为15 cm×20 cm。生物炭由沈阳大学环境学院提供。EM露从市场购买。

1.2 方法

1.2.1 除臭菌剂对鸡粪中甲基吲哚臭味含量的影响 除臭菌剂配方见表1，甲基吲哚的检测条件见表2。将A1、A2、A3、A4、A5、A0组分别用聚乙烯塑料袋密封发酵46 h后，打开硅胶管以0.2 L/min流速分别从A1、A2、A3、A4、A5、A0中各抽取5 L空气样品，将采样后的硅胶管中的硅胶分别放入解吸管中，各加入1 mL解吸液，盖紧盖解吸30 min并摇晃3～5次。以解吸液稀释标准溶液为30、45、60、80和100 mg/L的标准系列，各取1 L注入气相色谱仪，进行测定。每个浓度测定3次，取平均值，绘制标准曲线。在硅胶管中不采集空气，其余同样品操作作为空白对照。取1 μL样品，同标准溶液一样测定，用樣品峰高值减去空白对照峰高值，由标准曲线查得甲基吲哚浓度，再计算空气中甲基吲哚浓度。

1.2.2 生物炭对鸡粪中甲基吲哚含量的影响 将“1.2.1”中得出的最佳去除甲基吲哚的除臭菌剂配方称取6份，每份100 mL，并分别按照表3的配方添加不同质量的活性炭，记为B0、B1、B2、B3、B4、B5组。B0为空白对照组。将B0、B1、B2、B3、B4、B5这6种菌剂分别均匀喷洒到6份鸡粪样品中（每份鸡粪样品为1 kg），用聚乙烯塑料袋密封发酵46 h后，重复“1.2.1”的试验方法。

1.2.3 甲醇对鸡粪中甲基吲哚含量的影响 将“1.2.2”中得出的最佳去除甲基吲哚的除臭菌剂配方称取6份，每份100 mL，并按照表4分别添加不同含量的甲醇，记为C0、C1、C2、C3、C4、C5组。将C0、C1、C2、C3、C4、C5这6种菌剂分别均匀喷洒到6份鸡粪样品中（每份鸡粪样品为1 kg），用聚乙烯塑料袋密封发酵46 h后，重复“1.2.1”中的试验方法。

1.2.4 除臭菌剂对鸡粪中氨气含量的影响

1）氨气去除效果检测。取鸡粪样品6份，每份1 kg，按照表1配方在鸡粪中均匀喷洒除臭菌剂，分别记为A1、A2、A3、A4、A5、A0组，用聚乙烯塑料袋密封发酵46 h后，用采样机分别从A1、A2、A3、A4、A5、A0中各采集5 mL空气样品，并用吸收液定容到10 mL的样液，在样液中分别放入酚酞试剂，观察试验现象。

2）氨气含量检测。采样：采样系统由内装玻璃棉的双球玻璃管、吸收管、流量测量计和抽气泵组成，吸收瓶中装有10 mL吸收液，以1 L/min的流量采气10～20 L。

绘制标准曲线：取7只具塞10 mL比色管按表5制备标准色列。向各管中加入1 mL水杨酸-酒石酸钠溶液，2滴亚硝基铁氰化钠溶液，用水稀释至9 mL左右，加入2滴次氯酸钠溶液，用水稀释至标线，摇匀，放置1 h。用1 cm比色皿于波长697 nm处以水为参比测定吸光度。以扣除0号管的校正吸光度为纵坐标，氨含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定：按照表1除臭菌剂配方表将除臭菌剂均匀喷洒于鸡粪中，记为A1、A2、A3、A4、A5、A0组，密封发酵46 h后，用采样机采集5 mL空气样，用吸收液定容到10 mL的样液（用具塞比色管），按绘制标准曲线的步骤进行显色，测定吸光度。用吸收液代替试样溶液，按上述步骤重新测定（记为空白试验组）。

1.2.5 化学试剂对鸡粪中氨气含量的影响 取“1.2.4”中的最佳除臭菌剂配方6份，分别按表6添加二价铁离子和抗坏血酸，重复“1.2.4”中的试验操作步骤，记录数据。

1.2.6 除臭菌剂对鸡粪中硫化氢含量的影响

1）硫化氢去除效果检测。取鸡粪样品6份，每份1 kg，按照表1除臭菌剂配方将除臭菌剂均匀喷洒于鸡粪中，记为A1、A2、A3、A4、A5、A0组，密封发酵46 h后，用采样机采集5 mL空气样，用吸收液定容到10 mL的样液，在样液中分别放入硫酸亚铁试剂，观察试验现象。

2）硫化氢含量检测。标定硫代硫酸钠标准溶液的浓度：准确吸量20.00 mL 0.01 mol/L碘的标准溶液于250 mL碘量瓶中，加90 mL水、1 mL盐酸溶液、10 mL硫化钠溶液，混匀，放在暗处3 min。再用0.01 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加1 mL新配制的5 g/L淀粉溶液呈蓝色，用少量水冲洗瓶的内壁，再继续滴定至蓝色刚刚消失（由于有硫生成，使溶液呈微混浊色，此时要特别注意滴定终点颜色突变），记录所用硫代硫酸钠标准溶液的体积，同时另取10 mL水做空白滴定，其滴定步骤完全相同，记录空白滴定所用硫代硫酸钠标准溶液的体积。

采样：按照表1除臭菌剂配方表将除臭菌剂均匀喷洒于鸡粪中，记为A1、A2、A3、A4、A5、A0组，密封发酵46 h后，用一个内装10 mL吸收液的普通型气泡吸收管，以5 L/min流量避光采气15 L，采样4 h内做显色分析。

标准曲线的绘制：按表7制备标准色列管，先加吸收液，后加标准液，立即倒转混匀。在各管加1 mL混合显色液，加盖倒转一次，缓缓混合均匀，放置30 min。加1滴磷酸氢二钠溶液，摇匀，以排除Fe3+的颜色。用20 mm比色皿，以水作参比，在波长665 nm处，测定各管吸光度。以硫化氢含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，并计算。将已知渗透率的硫化氢渗透管在标定渗透率的温度下恒温24 h以上，用纯氮气以较小的流量（约250 mL/min），将渗透出来的硫化氢气体带出，并与空气进行混合和稀释，调节空气的流量得到不同浓度的硫化氢标准气体，计算硫化氢标准气体的浓度。

1.2.7 氧化锌对鸡粪中硫化氢含量的影响 分别取“1.2.6”中去除硫化氢效果最好的除臭菌剂配方6份，按表8添加氧化锌，记为E0、E1、E2、E3、E4、E5组。重复“1.2.6”的试验方法，记录结果。

2 结果与分析

2.1 除臭菌剂对鸡粪中甲基吲哚臭味去除效果的影响

由表9可以看出，除臭菌剂对甲基吲哚的去除效果显著。除臭菌剂配方的除臭效果从A1到A3依次增加，A3和A4除臭效果一样，A5的除臭效果最为明显，此时甲基吲哚的去除率高达89%。因此最佳除臭菌剂配方为A5。

2.2 生物炭对鸡粪中甲基吲哚臭味去除效果的影响

由表10可以看出，加入生物炭后的除臭菌剂配方对甲基吲哚的去除率以线性趋势明显增加。其中B5组的配方对甲基吲哚的去除率最为明显，因此最优配方为B5组。

2.3 甲醇对鸡粪中甲基吲哚臭味去除效果的影响

由表11可以看出，从C1到C3甲基吲哚的去除率明显增加，在C4时达到最大去除率90%，其甲基吲哚含量仅为0.001 0 mg/m2。在C5时甲基吲哚含量又明显增加。因此去除甲基吲哚的最优配方为C4组。

2.4 除臭菌剂对鸡粪中氨气去除效果的影响

由表12可以看出，从A1到A4氨气的含量有明显下降，在A4时含量最低，仅为0.101 1 mg/m2，在A5時氨气的含量增加到0.130 9 mg/m2。因此去除氨气的最优配方为A4组。

2.5 化学试剂对鸡粪中氨气去除效果的影响

由表13可以看出，在A4组中添加化学试剂后，氨气的含量从D1到D3有明显下降，D3的含量最低，仅为0.020 1 mg/m2，D4、D5的氨气含量相比D3增加明显。因此，去除氨气的最优配方为D3组。

2.6 除臭菌剂对鸡粪中硫化氢去除效果的影响

由表14可以看出，除臭菌剂对硫化氢含量的影响作用较大，硫化氢含量从A1到A2有明显下降，在A2、A3时硫化氢去除率呈现平稳趋势，去除率为88%。在A4时硫化氢含量最低，仅为0.010 2 mg/m2，在A5的硫化氢含量相比A3增加明显。因此，去除硫化氢的最优配方为A4组。

2.7 氧化锌对鸡粪中硫化氢去除效果的影响

由表15可以看出，在E4组除臭菌剂中加入化学试剂对硫化氢的去除效果增加明显。硫化氢含量从E1到E4有明显下降趋势。在E4时硫化氢含量最低，仅为0.004 2 mg/m2，E5的硫化氢含量相比E4增加明显。因此去除硫化氢的最优配方为E4组。

3 小结与讨论

家禽在饲养过程中会产生大量粪便，如处理不当，将对环境造成大量污染。传统的堆肥法堆肥腐熟需要2个月甚至半年，且堆置过程中堆肥周围恶臭难闻、污水横流、蚊蝇孳生，使人畜感染疾病。因此，家禽粪便的合理有效处理是保护农业环境、促进家禽生长的重要保障。造成家禽粪便恶臭的主要原因是氮的挥发以及硫化氢和甲基吲哚等气体的释放。堆肥在恶臭扩散的同时，会造成氮素大量损失，使氮肥减少，影响作物生长。传统堆肥过程是一个由自然微生物参与的过程，因而有可能利用添加外源微生物的办法调控堆肥中氮碳的代谢。通过减少氮类物质的分解，保留更多氮养分。

本研究通过用不同配方的除臭菌剂进行鸡粪堆肥对比，发现当放线菌5406、枯草芽孢杆菌B-903、卷枝毛霉、钾细菌、植物乳杆菌Z3-1和毕赤酵母含量都为25 mL时去除甲基吲哚效果最好，尤其在添加11 g生物炭及0.04 mg甲醇后，甲基吲哚去除率高达90%以上。当放线菌5406、枯草芽孢杆菌B-903、卷枝毛霉、钾细菌、植物乳杆菌Z3-1和毕赤酵母含量都为20 mL时去除氨气和硫化氢效果显著，在配方中添加0.06 g二价铁离子和抗坏血酸后，氨气的去除率明显增加，若在配方中添加0.08 mg氧化锌后，去除硫化氢效果最为明显。在本研究中利用益生菌抑制腐败菌、反硝化细菌和反硫化细菌的滋生，避免粪便中的蛋白质、氨基酸产生氨气、硫化氢和甲基吲哚等有臭味气体的产生。传统除臭菌剂中微生物种类单一且菌剂制作耗费成本大，保存时间短，除臭时间较长。本研究的家禽粪便除臭菌剂除了能有效去除硫化氢、氨气等恶臭气体，还能抑制腐生菌对蛋白质氨基酸进行氮化作用和抑制变形杆菌分解含硫的氨基酸，从根源上除去鸡粪的恶臭，对人体和动植物无任何毒副作用，对环境不产生任何污染，并且菌剂活化时间短，作用速度快，可快速除去臭味，快速杀菌，增加和保存鸡粪中氮肥。

研究结果表明，本研究的家禽粪便除臭菌剂是一种较为理想的环境友好型除臭菌剂，在农业及畜牧业中有着广阔的发展前景。其他特性和作用还有待于在以后的试验中进行深入的研究和探讨。

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