李元应

摘要 以35份马尾松种质资源为材料，研究马尾松嫩梢基因组DNA提取的最适方法；建立并优化马尾松ISSR反应体系；采用ISSR标记，结合聚类分析，对我国马尾松种质资源的遗传多样性进行了研究。结果表明：16条引物共扩增出153个条带，多态位点136个，每个引物检测到的条带数介于6～14之间；根据35份马尾松各资源的遗传系数进行聚类，可将35份资源划分为4个大类，即福建邵武、浙江仙居、江西德兴、福建连城各为1类，其余31份资源为1大类。

关键词 马尾松； ISSR；聚类分析；遗传多样性

中图分类号 S791.248 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0123-02

Abstract Using 35 accessions of Pinus massoniana as materials，optimum method of genomic DNA extracted from Pinus massoniana tender tip was studied，the ISSR reaction system was established and optimized，genetic diversity of Pinus massoniana was studied by ISSR markers and clustering analysis. The results showed that 16 primers amplified 153 bands among which had polymorphic loci 136，the percentage of polymorphic loci was 88.9%. The number of bands per primer detected among 6～14.According to the genetic coefficient，35 resources could be divided into 4 categories，namely Fujian Shaowu，Zhejiang Xianju，Jiangxi Dexing，Fujian Liancheng，the rest of the 31 resource for 1 categories..

Key words Pinus massoniana；ISSR；clustering analysis；genetic diversity

ISSR是一种用于构建PCR为基础的分子图谱的分子标记技术。为了揭示马尾松种源遗传多样性，本研究拟采用ISSR标记技术对35份马尾松资源的遗传多样性进行分析，以期揭示不同马尾松种源在DNA上的差异性[1-2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的35份马尾松资源均由福建省三明市大田县桃源国有林场种源试验基地提供，于2015年3月采其刚抽生的嫩梢，用冰块冷藏，运回实验室后置-20℃冰箱中保存，用于提取基因組DNA。35份马尾松资源编号及原产地见表1。

1.2 试验试剂

dNTPs（dNTP Mix）、Taq DNA聚合酶、CTAB、EDTA、Tris-HCl、β-巯基乙醇、PVP、琼脂糖、100 bp DNAladde Marker。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取与检测。参照Salah M等[3]提取植物基因组DNA的CTAB法，在此基础上，参考文献[4]对其进行改进。将提取的DNA样品中取出10 μL，稀释到1 000 μL，吸取适当体积上样于1%琼脂糖凝胶，在4～5 V/cm电泳仪中电泳15～20 min，干凝胶成像系统中观察并拍照，根据电泳条带判断DNA[5]质量。

1.3.2 ISSR-PCR扩增反应与引物筛选。参照罗晓莹等[6]的研究结果，构建基础反应体系：即25 μL反应体系，内含25 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgCl2、0.8 μmol/L引物、1×Buffer缓冲液、0.16 mmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，特定温度下退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，退出。

随机抽取一份DNA为模板，以Mg2+浓度、引物浓度、dNTP 浓度、DNA 模板浓度、aq DNA 聚合酶作为优化因子，以 UBC857（5′-（AC）8YG-3′）作为优化引物对反应体系进行优化。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶于3 V/cm电场中电泳，染色，观察并拍照。然后分别于50 、52、54 、55、56、58 、60 ℃温度下退火筛选引物，各引物Tm值计算公式如下：

Tm=2×（A+T） +4×（G+C）

式中，A、T、G、C为各碱基的碱基数。

1.4 数据处理

PCR扩增产物经电泳分离、染色显示后进行谱带观察、统计，对于同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为1个位点，扩增阳性、阴性的赋值分别为1、0，利用Excel 2000建立原始表征数据矩阵[7-8]，利用SPSS 11.5软件构建35份马尾松资源聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR最佳反应体系与反应程序的确立

经研究[9]确定最优的ISSR-PCR的扩增体系如下：在总体积25 μL的扩增反应中，包含50 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgCl2、0.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP、 1.0 UTaq DNA 聚合酶、1×Buffer缓冲液。引物扩增程序同1.3.2，4 ℃保存。

2.2 ISSR引物筛选结果及扩增结果分析

从60条引物中筛选出16条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应，各引物序列及扩增情况见表2。可以看出，在检测到的153个条带中，有多态位点的达136个，占比88.9%。每条引物检测到的条带数在6～14个之间，平均为9.6个；有多态位点的条带数在6～13个，平均为8.5个。扩增片断长度在200～4 000 bp之间，UBC827ISSR扩增谱带见图1。其中，扩增位点最多的是引物UBC855，其扩增位点数为14；其次为UBC840，扩增位点数13；最少的是引物UBC846、UBC850和UBC881，均有6条清晰条带。

2.3 马尾松ISSR遗传多样性的聚类分析

利用SPSS 11.5的聚类分析功能计算35份马尾松资源的遗传相似系数（GS）。结果表明，35份供试样品之间的GS值平均为0.503。其中，福建三明和福建閩清之间的GS值最大，为1，说明两者之间的遗传基础相似。湖北红安与湖南常宁的GS值为0.936、福建武平与福建永安的GS值为0.924、湖南慈利与江西靖江的GS值为0.891、安徽屯溪与安徽潜山之间的GS值为0.871，均>0.87，说明它们之间的基因组组成和核苷酸序列比较相似。而福建邵武与湖南江永和江西靖江的GS值均为0，即遗传距离为1，表明它们的亲缘关系最远。福建邵武与其他34份样品的GS值均在0.357以下，且仅与2个样品间相似系数>0.3，说明其与其他样品间的差异较大[10-13]。

遗传相似系数的结果利用SPSS 11.5做出聚类树型图，聚类结果见图2。在D=0.41处做第一等级划分，可将35份样本分为1个大类和4个独立的个类，即福建邵武、浙江仙居、江西德兴、福建连城各自聚为1类，其余31份样品聚为1大类；在D=0.55处做第二等级划分，可将35份样本分为1个大类群、2个小类和7个独立的个类。第一大类有福建三明、福建闽清、湖南江永、江西靖江、湖南绥宁、江西万载、安徽屯溪、安徽潜山、湖南慈利、四川涪陵、陕西城固、湖北红安、湖南常宁、广西忻城、福建武平、福建漳平、湖南临湘、浙江嵊县、浙江庆元、广东韶关、广西恭城、广东罗定、贵州贵阳；贵州黄平和贵州都匀聚为一小类；江西武宁和广东广宁聚为另一小类；福建邵武、四川南江、浙江仙居、江西德兴、江西余江、贵州都匀、湖北远安则为7个独立的个类[10-13]。

3 结论与讨论

经ISSR-PCR的扩增体系共筛选出16条ISSR引物，用其对35份马尾松样品进行扩增，在检测到的153个条带中，有多态位点的达136个，占比88.9%，且每个引物检测到的条带数介于6～14之间，证明ISSR可以准确分析马尾松种源的遗传多样性。

基于35份马尾松资源的遗传系数，35份资源可划分出4个大类，即福建邵武、浙江仙居、江西德兴、福建连城各自聚为1类，其余31份样品聚为1大类。这表明，亲缘关系与纬度相关，划分类群与地理起源明显相关；品种之间遗传背景相似，划分的类群与原产地相关性很高，说明与其他地区马尾松品种间基因交流较少，在长期栽培过程中以经济性状、抗性等用途为目标的地域之间的品种交换并不频繁[10-13]。在以后的试验中，除了考虑各种源原产地的纬度外，还要加大种源采样的密度，促使试验更完善。

4 参考文献

[1] 李丹，彭少麟.马尾松地理种源遗传变异规律研究的综述与分析[J].应用生态学报，2000，11（2）：293-296.

[2] 卢兆银，李志辉，黄丽群.马尾松种源试验研究[J].中南林学院学报，2006，26（3）：5-10.

[3] AIJANABI S，MARTINEZ I.Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR -based techniques[J].Nucleic Acids Rese-arch，1997，25（22）：4 692 -4 693.

[4] 张博，张露，诸葛强，等.一种高效的树木总DNA提取方法[J].南京林业大学学报（自然科学版），2004，28（1）：13-16.

[5] 陈桂信，吕柳新，赖钟雄，等.木奈基因组DNA的提取与纯化[J].江西农业大学学报，2004，26（3）：329-333.

[6] 罗晓莹，庄雪影，杨跃生.杜鹃红山茶遗传多样性的ISSR分析[J].热带亚热带植物学报，2007，15（3）：93-100.

[7] 姚明哲，陈亮，王新超，等.我国茶树无性系品种遗传多样性和亲缘关系的ISSR分析[J].作物学报，2007，33（4）：598-604.

[8] 于小玉，喻方圆，刘建兵，等.ISSR在油茶品种鉴别和遗传多样性分析中的应用[J].南京林业大学学报（自然科学版），2013，37（1）：61-66.

[9] 李超，罗淑萍，曾斌，等.新疆核桃种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].中国农业科学，2011，44（9）：1871-1879.

[10] 刘爱萍.中国12个省（区）马尾松主要种质资源的RAPD与ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2007.

[11] 连青龙.马尾松（Pinus massoniana Lamb.）优良无性系的RAPD与ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2008.

[12] 童燕霞.福建省杨梅不同品种的RAPD分析[D].福州：福建农林大学，2007.

[13] 姜自红.珍珠黄杨遗传多样性研究及保护对策[D].南京：南京林业大学，2007.