马雪倩，俞佳斌，马芳

(1.四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病及西部妇幼研究院四川大学-香港中文大学生殖医学联合实验室，成都 610000；2.四川大学华西第二医院妇产科，成都 610041；3.东南大学临床医学院，南京 210009；4.浙江大学医学院附属妇产科医院，杭州 31006)

女性垂体促性腺激素糖基化修饰的含量及作用机制研究进展

马雪倩1，4，俞佳斌3，马芳1，2*

(1.四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病及西部妇幼研究院四川大学-香港中文大学生殖医学联合实验室，成都 610000；2.四川大学华西第二医院妇产科，成都 610041；3.东南大学临床医学院，南京 210009；4.浙江大学医学院附属妇产科医院，杭州 31006)

卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)在正常女性生理周期中的含量变化呈现一定的波动性，并且其肽链末端糖基(唾液酸以及磺化乙酰半乳糖胺)的含量也相对出现一些变化。现已明确，这两种激素上的唾液酸和磺化乙酰半乳糖胺均是在蛋白合成之后，由半乳糖转移酶和乙酰半乳糖胺转移酶在FSH及LH 的肽链末端通过天门冬氨酸残基诱导形成。由于这两种酶对FSH及LH 的相对活性不同，使得FSH的性质主要受唾液酸影响，而LH则主要受磺化乙酰半乳糖胺影响。这两种糖基也通过不同的机制影响着女性垂体促性腺激素的半衰期、酸碱性、稳定性等性质，并通过下游的信号通路对后面的性激素合成等带来改变。

卵泡刺激素； 黄体生成素； 唾液酸； 磺化乙酰半乳糖胺

(JReprodMed2017，26(2)：183-187)

卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)是女性重要的促性腺激素，它们除了具有调节女性生理周期、诱导排卵等作用以外，也是目前临床上用于促排卵及疾病治疗等操作的关键药物[1-2]。虽然近年这两种药物提取与制造工艺不断改进，但是其临床效果却往往随着剂量、类型的不同有着较大的差异。目前最新研究认为，这种效果上的差异很可能来源于其糖基化(主要是唾液酸化和磺化)的类型与数目的不同[3]。一直以来关于这两种激素糖基化的含量改变、功能原理的文献并不多，以致于学术界对这个问题并没有充分地认识及解决。本文将总结近年来关于女性垂体促性腺激素糖基化的相关文章，对其规律、特点、功能及相关假说进行概述，期望能够给相关的研究及应用提供总结式参考，并对如何提高临床上排卵成功率等问题带来一些建议或思考。

一、促性腺激素糖基化修饰概述

FSH和LH均由垂体的嗜碱性细胞合成和分泌。FSH分子量约33 000，LH约30 000，均是异二聚体，由α和β两个亚基组成。两者的α亚基相似，由同一个基因所编码，92个氨基酸构成，其作用主要是决定和维持多肽链的生物活性；而β亚基则略有不同，这也是造成两者功能性质上差异的原因之一[4]。

在女性体内，FSH及LH由垂体进行脉冲式发放进入血液循环到达卵巢，通过与成熟卵泡的相互作用从而达到调节女性生理周期、诱导排卵、调节性激素以及调节妊娠等作用[5]。此外，FSH也一直是临床上体外受精(IVF)中用于促排卵的主要药物[6]。历史上先后用过多种来源的FSH，从孕马尿、孕妇尿到提取的尿源性FSH、实验室纯化以及重组合成的FSH进行治疗[7]。近年的研究发现，绝经妇女尿中提取的垂体促性腺激素与体外重组的垂体促性腺激素，以及正常年轻女性垂体促性腺激素相比，其肽链末端特定位置的糖基化有一定的差异[8-9]。提示不同的糖基化修饰会在一定程度上影响FSH及LH的性质与功能。研究表明，在正常的FSH及LH 分子上，其β亚基含有2个N连接的糖基化位点以及4个O连接的糖基化位点，糖基化数量或位置的差异往往会对其性质造成影响[10]。通过电泳等方式，确定这两种激素末端的糖基主要有唾液酸(sialic acids)及磺化的乙酰半乳糖胺(sulfonated N-acetylgalactosamine，sulfonated GalNAc)。这两种阴离子糖基对FSH和LH的半衰期、稳定性、酸碱性及功能有重要影响[11-12]。

二、促性腺激素及糖基化含量

研究人员通过大量实验，研究处于月经周期的不同时段的正常女性、绝经后妇女、多囊卵巢综合征(PCOS)患者血液里FSH、LH糖基的含量，以及肽链末端磺化乙酰半乳糖胺和唾液酸个数的波动状况。

1.正常月经周期：现已明确，血清中FSH及LH的浓度在上一周期结束的时候，均达到整个周期的最低点。此后均以不同的速率及波动幅度上升，大约在月经中期，即排卵前后，分别达到峰值，之后再缓慢下降。而这两种激素上唾液酸和乙酰半乳糖胺的含量变化则相对复杂。

Wide等[13]研究表明在正常月经周期中FSH上唾液酸糖基的表达成明显的M形，其在月经中期以及周期首尾最低，而在三个低谷之间，也就是在排卵期前后含量最高；另一方面，磺化乙酰半乳糖胺在LH上明显表达为V形，在月经中期达最低点，其前后表现为迅速下降或上升。提示FSH及LH上的唾液酸糖基及乙酰半乳糖胺基团的含量波动可能与排卵的发生有关联。其作为影响这两种促性腺激素与靶细胞受体相互作用的重要糖基，可协助诱导在靶细胞内产生cAMP(环化一磷酸鸟苷)或IP(磷酸肌醇)作为第二信使向下游进行信号转导，从而影响卵泡的发育和调节类固醇激素的产生。

2.绝经后：实验人员对绝经后妇女血清中FSH、LH进行了测定[14]。结果表明，绝经后女性FSH及LH的酸性较其他阶段女性的明显增强，两种分子上的唾液酸含量均在绝经后达到最高，而乙酰半乳糖胺含量则相对滤泡期和黄体期明显降低，仅相当于月经中期的含量。在这个时期，FSH的稳定性也显著上升，提示唾液酸糖基数的增加或乙酰半乳糖胺的减少对于激素本身的半衰期、酸碱性等带来影响。而在人工促排卵、体外受精的操作过程中，曾经使用绝经妇女的尿液中提取出的FSH，但其效果与后来体外重组得到的FSH相比略有差异，除了提取工艺造成的浓度、纯度差异以外，目前认为其上这两种糖基的含量及分布差异是更重要的原因[8]。

3.PCOS患者：PCOS患者血清中典型的促性腺激素变化是FSH低下伴随LH升高，LH甚至高于滤泡期。但LH分子上的乙酰半乳糖胺明显下降，而唾液酸含量则有所上升，高于滤泡期和黄体期[15]，这个现象与绝经后妇女表现出一定的相似性。此外，发现PCOS患者血清中FSH的唾液酸成分增多并伴随乙酰半乳糖胺的减少，甚至出现了相当比例(92%)的不含后者的FSH分子[14]。

将PCOS患者按照体重指数(BMI)的不同分为肥胖与非肥胖，发现这两类患者FSH及LH上乙酰半乳糖胺的含量变化与BMI呈现一定的相关性，肥胖患者FSH和LH分子上乙酰半乳糖胺的含量总体而言高于非肥胖患者[14]。提示对于PCOS患者，尽管临床症状主要由下丘脑-垂体-卵巢轴的激素紊乱造成，但唾液酸的增多以及乙酰半乳糖胺的减少同样与患者的卵泡发育异常及排卵障碍的发生有关，并会通过一定的机制影响症状的表现强度[16]。

三、促性腺激素糖基化机制研究现状

研究表明FSH和LH的亚基的N端附近均含有数目不等的由天门冬酰胺(Asn)连接的单糖，这其中包括着唾液酸以及磺化乙酰半乳糖胺[17]。在磺化的单糖附近往往会有SO4-4GalNAcβ1，4GlcNAcβ1，2Manα这样的序列诱导形成单或双磺化结构，用以诱导形成磺化糖基[13]。而相比之下，唾液酸单糖结构的附近序列则表现出很强的结构差异性。

FSH和LH在垂体嗜碱性细胞中完成蛋白前体的合成与初步修饰之后，会在N端的乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)的引导下进入中间高尔基网，在高尔基网反面将不同的糖基催化连接到特定的Asn上，共同作为之后糖基化的底物。此处有两种糖基化的关键酶，分别是半乳糖转移酶(β1-4galactosyltransferase)催化形成唾液酸基团，以及乙酰半乳糖胺转移酶(β1-4GalNAc-transferase)催化生成磺化乙酰半乳糖胺基团[18]。在肽链的N端具体形成哪一种糖基则取决于两种酶的相对活性。乙酰半乳糖胺转移酶可以识别LH分子β亚基上的脯氨酸-亮氨酸-精氨酸(Pro-Leu-Arg)三肽结构，后者可以诱导增强该酶的活性，从而生成更多的磺化乙酰半乳糖胺[19-20]。而这种三肽序列并没有表达在FSH的β亚基上，此外，FSH的α亚基上这一序列也因为一些原因被掩盖住，使其无法诱导乙酰半乳糖胺转移酶的活性。因此在FSH上半乳糖转移酶的作用更加明显，使得FSH上唾液酸化相对更强[21]。也因此认为唾液酸对FSH的性质和功能的影响更强，而磺化乙酰半乳糖胺对LH的影响则较为显著。

四、糖基化影响促性腺激素性质的生化机制研究进展

唾液酸与磺化乙酰半乳糖胺连接在这两种促性腺激素的肽链N端，通过不同的机制来影响后者的理化性质和功能，如半衰期、稳定性、受体结合特性、下游信号转导以及促分泌作用等，并参与其在卵巢中的各种功能[22]。

唾液酸分子存在于FSH两种亚基上，可以隐藏分子上的抗原性位点，而后者能够诱导激活部分分解代谢的受体，从而避免FSH被巨噬细胞或肝细胞上的Gal识别受体所识别结合而被降解掉，延长分子的半衰期，增加稳定性[23]。现已通过啮齿类动物证明，存在于LH分子表面上的磺化乙酰半乳糖胺，同样可以被肝细胞表面特异性受体识别结合，使得LH分子被肝细胞代谢清除[24]，破坏LH的稳定性与缩短半衰期。此外，糖基化的存在会影响FSH与LH的酸碱性。前已述及，绝经妇女及PCOS患者血中FSH及LH的酸性均较育龄期正常女性的高[14]，这与两种蛋白表面酸性的唾液酸单糖分子含量上升，乙酰半乳糖胺下降有关。

另一方面，由于糖基化的存在，使得这两种激素的α与β 亚基分别有了不同的特性。α亚基以及两种亚基上的糖基化修饰显著影响激素与受体结合的亲和性与反应活性，去糖基化的α、β亚基生物活性会被明显抑制，甚至出现拮抗效应[25]。Martin等[26]已通过定点突变及转染等方式对由Asn介导的糖基化位点的相关特性进行探究，结果表明αAsn78上糖基化活性较低，数量较少，其产生的作用相对不明显。Davis 等[27]研究表明，αAsn52位是重要的唾液酸化位点，在此位点上不同形式和数目的唾液酸化会给FSH的结构带来较大的改变。Baenziger[21]的研究也表明，αAsn52位上的糖基可协助刺激下游信号转导产生cAMP或IP信使分子，从而进一步影响固醇的合成。

对于β亚基，Keutmann等[28]实验证明，β亚基在高浓度作用时即可与卵泡颗粒细胞上的受体结合并通过下游信号转导刺激后续的固醇类激素产生。说明在与受体结合时，主要由β亚基的肽链结构决定与受体结合的特异性。Nguyen等[29]证实βAsn13及βAsn30糖基非常丰富，并且相比之下，前者在促进性激素分泌上的作用更明显。此外，有研究认为在低浓度糖基化时促进生成cAMP分子，在高浓度时则偏向于通过IP信号通路影响下游的信息传递[30]。

五、糖基化的差异在辅助生殖技术中的影响

值得一提的是，FSH是国内外辅助生殖技术中用于促排卵的关键药物，然而目前各大辅助生殖中心对于FSH类型与来源的选择不尽相同。现在最常见的有由绝经妇女的尿中所提取纯化出的高纯度尿源性FSH(uFSH)以及利用重组技术合成的重组人FSH(rhFSH)，前者含有比例较高的酸性FSH亚型，相比之下后者的酸性则较低，稳定性较差[31]。有报道认为，酸性较高的uFSH在促排卵的生物活性低于rhFSH，后者的临床有效率及妊娠率高于前者[32]。叶虹[33]研究提示，uFSH与rhFSH的主要差异即来源于其上糖基化的不同。而鉴于LH在辅助生殖技术中的直接应用较少，通常是利用HCG代替或利用其它药物避免LH峰的发生，故对LH的糖基化差异在辅助生殖中的研究较少。

综上所述，目前仅有少部分研究将目光聚集在垂体促性腺激素的糖基化上，包括糖基化的数目和影响后期与卵泡相互作用的分子机制。通过对相同的FSH、LH肽链上进行不同的糖基化，有望在一定程度上调节其性质并作为用相关疾病药物治疗，如临床上促排卵、PCOS治疗等的新的改进入手点。遗憾的是，到目前为止还没有将这个问题完全解释清楚。本文通过总结近年来关于FSH和LH糖基化的相关文献，尽量将目前的研究成果进行完善和梳理。希望本文能从一个新的方向上对相关临床用药和实验室研究带来启发与思考，并对女性促性腺激素作为药物对疾病治疗的发展做出贡献。

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[编辑：罗宏志]

Study on development of female pituitary gonadotrophin glycosylation content and its mechanism

MAXue-qian1，4，YUJia-bin3，MAFang1，2*

1.SichuanUniversity-theChineseUniversityofHongKongJointLaboratoryforReproductiveMedicine，KeyLaboratoryofObstetric，GynecologicandPediatricDiseasesandBirthDefectsofMinistryofEducation，WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610000 2.DepartmentofObstetrics&Gynecology，WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041 3.ChinaSoutheastUniversityMedicalCollege，Nanjing210009 4.Women'sHospitalSchoolofMedicineZhejingUniversity,Hangzhou310006

The contents of FSH and LH show a certain degree of volatility in normal menstrual cycle，while the contents of sialic acids and sulfonated N-acetylgalactosamine also show fluctuant changes.Now the scientific research has proved that sialic acids and sulfonated N-acetylgalactosamine are synthesized by β1-4galactosyltransferase and β1-4GalNAc-transferase though aspartic acid induction at the end of peptide chain of FSH and LH after the peptides synthesis of the two hormones.As the relative activity of the two enzymes on FSH and LH is different，the nature of FSH is mainly influenced by sialic acid and LH by the sulfonated acetyl-galactosamine.Therefore the glycosyls influence the properties of hormones such as half-life，stability through different mechanism.They also bring some changes in the synthesis of sex hormone through the downstream signal pathway.

FSH； LH； Sialic acid； Sulfonated N-acetylgalactosamine

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.02.017

2016-05-23；

2016-07-11

四川省科技厅项目(2015SZ0173)

马雪倩，女，陕西西安人，硕士研究生，妇产科生殖医学专业.(*

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