俞雷钧

（浙江省立同德医院骨伤科，浙江杭州 310012）

掺锶聚磷酸钙骨修复材料的制备及其对成骨细胞增殖的影响

俞雷钧

（浙江省立同德医院骨伤科，浙江杭州 310012）

目的改进聚磷酸钙的力学特性和生物活性，为临床骨修复提供新材料。方法制备掺锶聚磷酸钙骨修复材料，采用万能材料试验机测试抗压强度，并采用噻唑蓝（MTT）比色法考察其对成骨细胞增殖的影响。结果掺锶聚磷酸钙多孔支架的抗压强度为（212.4±5.3）MPa，明显大于聚磷酸钙多孔支架的（172.5±8.3）MPa（P＜0.05）；掺锶聚磷酸钙多孔支架降解0，7，14，21 d时的抗压强度均大于聚磷酸钙多孔支架，差异均有统计学意义（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）。MTT比色法结果表明，培养3，4，5 d后，掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙作用的成骨细胞的吸光度（A）值高于阴性对照，差异均有统计学意义（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；培养4，5 d后，掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞的A值高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义（t＝2.733，2.038，P＜0.05）。结论新型骨修复材料掺锶聚磷酸钙具有良好的抗压特性，并能促进成骨细胞的增殖，具有良好的临床应用前景。

掺锶聚磷酸钙；骨修复材料；抗压强度；成骨细胞增殖

骨修复材料的研究核心，在于制作可作为支架的生物相容性材料，并能与细胞复合，这就要求骨修复材料必须有良好的细胞相容性，置入体内后，其生物降解速率应与骨的生理生长速率相匹配，且降解产物应对正常组织无毒性；此外，骨修复材料还应能诱导骨内形成新的血管以供给细胞营养，并促进自身降解[1－3]。优良的骨修复材料应具有良好的力学强度，并有利于骨修复阶段中成骨作用。聚磷酸钙是近年来临床应用广泛的骨修复材料，具有良好的生物活性、生物相容性与生物可降解性[4]。锶是人体的必需元素，具有促进骨形成、抑制骨吸收的作用。将锶元素掺入聚磷酸钙中，可能会改变聚磷酸钙的生物活性[5]。据此，笔者制备了一种新型的掺锶聚磷酸钙骨修复材料，并考察其对成骨细胞增殖的影响，旨在改进聚磷酸钙的力学特性和生物活性，为骨科临床提供新的骨修复材料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器

AG－10TA型电子万能试验机（日本岛津公司）；MCO－18AIC型二氧化碳恒温培养箱（日本三洋公司）；BIO－RAD608型酶标仪（美国BioRad公司）；IX2－SL型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

1.1.2 材料与试药

大鼠ROS17／2.8成骨细胞株，购自四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室。碳酸锶（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号为1405231）；碳酸钙（分析纯，国药化学试剂有限公司，批号为150117）；DMEM培养基、胰酶（美国GIBCO公司）；胎牛血清（北京圣马元亨生物制品研究所）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）；聚乙烯醇（分析纯，重庆北碚精细化工厂）；磷酸、二甲亚砜、乙酸异戊酯、无水乙醇（国药化学试剂有限公司），均为分析纯。

1.2 制备方法

按照锶／钙的物质的量百分比5%分别称取碳酸锶和碳酸钙，加入磷酸溶液中反应，生成相应的磷酸二氢盐，室温放置至少12 h，用无水乙醇去除剩余的磷酸至pH＝6，将上述混合盐置坩埚内，500℃恒温下煅烧12 h，再以15℃／min的速率逐渐升温至1 200℃，此时混合盐熔融，再保温1 h后淬火，获得掺锶聚磷酸钙无定型烧料。研磨无定型烧料，过200目筛，另取过60目筛硬脂酸作为致孔剂，聚乙烯醇作为黏合剂，与掺锶聚磷酸钙粉末充分混合，压制成高20 mm、直径10 mm的胚，在800℃恒温下持续烧制3 h，制得含锶量物质的量百分比为5%的掺锶聚磷酸钙多孔支架。

1.3 抗压强度测定

采用万能材料试验机，设置加压速度为6 mm／min，测定掺锶聚磷酸钙多孔支架的轴向破坏载荷，并根据破坏载荷和材料的截面积计算抗压强度。此外，评价掺锶聚磷酸钙多孔支架在降解过程中的抗压强度，采用恒温水浴振荡器，振荡频率为2 Hz，温度为（37±0.5）℃，降解液采用三羟基甲基氨基甲烷的氯化氢溶液，试验pH模拟生理pH（7.4±0.2），并以不加锶的聚磷酸钙多孔支架作为对照，分别于0，7，14，21 d时取出多孔支架，测定抗压强度，比较抗压强度的差异。

1.4 成骨细胞增殖情况考察

不同材料对成骨细胞增殖的影响采用噻唑蓝(MTT)比色法检测[6－7]。将掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙在121℃下高压灭菌20 min，按照培养液与试样表面积之比为100 L／m2，无菌浸提72 h制作材料浸提液。在96孔板的每孔中加入成骨细胞悬液与材料浸提液各100 μL，成骨细胞接种浓度4×107／L；阴性对照孔则仅加入200 μL培养液（n＝8）；37℃恒温培养。分别在培养1，2，3，4，5 d后加入20 μL MTT，并继续培养4 h，再吸出孔中的培养液，每孔加二甲基亚砜150 μL，置振荡器上振荡15 min，然后采用酶标仪测定各个孔在570 nm波长的吸光度(A)值，得到成骨细胞的增殖情况。

1.5 统计学处理

应用SPSS 22.0统计学软件处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验，检验水准为α＝0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗压强度

掺锶聚磷酸钙多孔支架的抗压强度明显大于聚磷酸钙多孔支架（P＜0.05）；掺锶聚磷酸钙多孔支架降解0，7，14，21 d时的抗压强度均大于聚磷酸钙多孔支架，差异均有统计学意义（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）。详见表1。

2.2 成骨细胞增殖情况

MTT比色法结果显示，培养3，4，5 d后，掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的A值高于阴性对照，差异均有统计学意义（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；培养4，5 d后，掺锶聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的A值高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义（t＝2.733，2.038，P＜0.05）。详见表2。

表1 降解过程中不同骨修复材料的抗压强度（±s，MPa，n＝5）

表1 降解过程中不同骨修复材料的抗压强度（±s，MPa，n＝5）

注：与聚磷酸钙多孔支架比较，aP＜0.05。

骨修复材料掺锶聚磷酸钙多孔支架聚磷酸钙多孔支架21 d 150.6±12.0a94.8±11.7 0 d 212.4±5.3a172.5±8.3 7 d 168.3±9.4a117.3±10.2 14 d 155.9±10.4a103.6±9.5

表2 不同材料对成骨细胞增殖的影响（±s）

表2 不同材料对成骨细胞增殖的影响（±s）

注：与阴性对照比较，aP＜0.05；与聚磷酸钙比较，bP＜0.05。

材料A值掺锶聚磷酸钙聚磷酸钙阴性对照1 d 0.21±0.10 0.24±0.10 0.22±0.08 2 d 0.30±0.11 0.32±0.12 0.25±0.07 3 d 0.49±0.17a0.41±0.06a0.32±0.08 4 d 0.65±0.10ab0.52±0.09a0.35±0.10 5 d 0.67±0.18ab0.51±0.13a0.34±0.10

3 讨论

骨科手术需要植入生物材料与组织工程移植物，其中聚磷酸钙是非常重要的组织工程材料，具有良好的生物相容性[5，8－9]。血管生成及再生在机体的生理中十分重要，在骨组织伤口的愈合过程中更是如此，这在一定程度上决定了患者的预后[10]。但植入组织工程材料后的局部血管形成过程十分缓慢，想达到大尺寸移植物及血管组织的有效血管化较困难。故众多研究致力于改善植入后的血管生成，虽取得了较理想的效果，但仍需加入其他物质对移植物进行物理性和化学性修饰，修饰方法较复杂，临床应用受限。

锶是人体的必需营养元素，其质量约占人体骨总质量的万分之一[11]，主要分布于骨骼和牙齿中，机体约99%的锶存在于骨骼中。锶在机体中可抑制破骨细胞的活性及增殖，从而抑制骨吸收；同时，锶能加速成骨细胞的分化，并促进前成骨细胞的增殖，从而加速成骨过程。但应注意，锶在相应局部必须达到一定的有效浓度才能发挥相应的效果[12]。

当组织工程移植物植入机体内后，其力学强度会不同程度地受到人体的影响，其中，生物陶瓷类材料的力学强度受影响最大，其力学强度通常衰减明显。因此，降低植入材料的力学强度衰减也成为组织材料的研究热点。制备掺锶聚磷酸钙后，必须验证其抗压强度，否则无法成为适宜的骨修复材料。本研究结果表明，在聚磷酸钙骨修复材料中掺入一定量的锶，可明显提高聚磷酸钙材料的抗压强度，且在降解过程中抗压强度仍高于普通聚磷酸钙材料，表明加入锶元素后可有效减缓聚磷酸钙的力学强度衰减量。

成骨细胞是促进骨形成的重要功能性细胞，主要负责骨基质的合成、分泌与矿化过程。机体中的骨组织不停地进行重建，主要包括：破骨细胞黏附于旧骨组织区域，分泌出可溶解骨组织中矿物质的酸性物质，并可分泌蛋白酶消解骨基质中的蛋白质成分，从而形成骨吸收的典型陷窝结构；此外，成骨细胞黏附于被吸收的骨组织部位，分泌出骨基质，并进一步矿化成为新的骨组织。破骨细胞和成骨细胞之间的作用平衡是维持人体正常骨总量的关键因素，而在骨科手术后的骨修复阶段中成骨作用应占优势。因此，优良的骨修复材料也应有利于成骨作用。MTT比色法结果显示，掺锶聚磷酸钙材料对成骨细胞的增殖具有更强的促进作用。这是由于掺锶聚磷酸骨修复材料浸提后，加上材料本身降解可释放出一定浓度的锶离子，作用于成骨细胞后，可激活成骨细胞中表达钙敏感受体，从而激活三磷酸肌醇促有丝分裂蛋白激酶信号传导通道，使成骨细胞更好地生长和增殖[13]。

综上所述，新型骨修复材料掺锶聚磷酸钙具有良好的抗压特性，并能促进成骨细胞的增殖，具有良好的临床应用前景。

[1]Qin H，Yang Z，Li L，et al.A promising scaffold with excellent cytocompatibility and pro－angiogenesis action for dental tissue engineering：Strontium－doped calcium polyphosphate[J].Dent Mater J，2016，35（2）：241－249.

[2]王淑红，赵鹏，张劲娥，等.新型聚己内酯／磷酸钙支架的制备及生物相容性研究[J].中国生物医学工程学报，2012，31（2）：300－306.

[3]郭小凡，范长春，曹学成，等.壳聚糖包裹的多孔聚磷酸钙生物陶瓷复合兔成骨细胞的实验研究[J].山东医药，2012，52（46）：12－15.

[4]Kang P，Xie X，Tan Z，et al.Repairing defect and preventing collapse of femoral head in a steroid－induced osteonecrotic of femoral head animal model usingstrontium－doped calcium polyphosphate combined BM－MNCs[J].J Mater Sci Mater Med，2015，26（2）：80－81.

[5]付维力，王践云，李箭，等.半月板纤维软骨细胞与壳聚糖／聚磷酸钙体外复合培养的实验研究[J].中国运动医学杂志，2012，31（1）：53－58.

[6]Fu WL，Xiang Z，Huang FG，et al.Coculture of peripheral bloodderived mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells on strontium－doped calcium polyphosphate scaffolds to generate vascularized engineered bone[J].Tissue Eng Part A，2015，21（5－6）：948－959.

[7]彭红，顾志鹏，黄程程，等.掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化[J].中国组织工程研究，2014，18（3）：365－370.

[8]王彦平，朱凌云，张红梅.聚磷酸钙纤维／羟基磷灰石／明胶软骨组织工程支架材料的制备及性能[J].中国组织工程研究，2012，16（43）：8005－8008.

[9]陈娟娟，梁翠薇，叶财敏，等.磷酸钙／聚乳酸羟基乙酸复合骨水泥对破骨前体细胞炎症因子表达的影响[J].口腔医学，2016，36（4）：289－293.

[10]吴建煌，丁州，雷青，等.利福平－聚乳酸－羟基乙酸－磷酸钙骨水泥缓释复合体的实验研究[J].中南大学学报：医学版，2016，41（9）：946－954.

[11]敬起飞，张旭，谢蟪旭，等.多孔复合掺杂聚磷酸钙支架骨修复材料的制备及其性能[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（38）：7045－7048.

[12]赵海燕，夏亚一，康鹏德.掺锶聚磷酸钙修复股骨头坏死骨缺损过程中VEGF表达的实验研究[J].中国矫形外科杂志，2010，18（10）：844－848.

[13]宋炎成，曾春，金文涛，等.掺锶聚磷酸钙的细胞相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（42）：7843－7848.

Preparation of Strontium Calcium Phosphate Bone RepairM aterial and Its Effect on the Proliferation of Osteoblasts

Yu Leijun

（Department of Orthopaedics and Traumatology，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou，Zhejiang，China310012）

ObjectiveTo improve the mechanical properties and biological activity of calcium phosphate，and to provide a new bone repair material for orthopedics clinic.M ethodsStrontium doped calcium phosphate bone repair material was prepared，compressive strength wastestedbyuniversalmaterialtestingmachine，andMTTmethodwasusedtoinvestigateitseffect ontheproliferationof osteoblasts.ResultsThe compressive strength of strontium doped calcium phosphate porous scaffold was（212.4±5.3）MPa.After degradation for 0 d，7 d，14 d and 21 d，the compressive strength of strontium doped calcium phosphate were greater than that of calcium phosphate porous scaffold，and the differences were statistically significant（t＝8.907，8.222，8.302，7.445，P＜0.05）.The MTT results indicated that 3d，4 d，5d after culture，A values of extracts osteoblast of strontium doped calcium polyphosphate and calcium polyphosphate were higher than negative control，the differences were statistically significant（t＝2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P＜0.05）；After culture for 4 d and 5 d，the A value of the osteoblast in extraction solution of calcium doped calcium phosphate were higher than those of calcium phosphate，and the differences were statistically significant（t＝2.733，2.038，P＜0.05）.ConclusionAs a new bone repair material，strontium doped calcium phosphate has good compressive properties，and can promote the proliferation of osteoblasts，has a good clinical application prospects.

strontium doped calcium phosphate；bone repair materials；compressive strength；osteoblast proliferation

R608；R965

A

1006－4931(2017)02－0013－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.004

2016－10－07；

2016－11－14)

浙江省科学技术厅2014年合作研发和成果转化项目[2014F50005]。

俞雷钧，男，大学本科，主任中医师，研究方向为脊柱退行性疾病的诊治，(电话)0571－89972351。