麦芽炒香过程中有效成分与无效成分动态变化规律研究

2017-04-07杨华生谭丽霞吴维刚黎晓丽

中国中药杂志 2016年23期

杨华生++谭丽霞++吴维刚++黎晓丽++闻丽珍++吴璐

[摘要]僅从麦芽中淀粉酶、麦黄酮等“有效成分”的角度并不能科学阐释炒麦芽“消食化滞”作用较生麦芽更强的作用机制，该实验采用HPLC测定麦芽炒制过程中麦黄酮、槲皮素、山柰酚、儿茶素、阿魏酸等传统“有效成分”及5羟甲基糠醛、丙烯酰胺等“无效成分”的含量，运用HCA，PCA，PLSDA分析炒制过程中“有效成分”与“无效成分”的动态变化规律。结果HCA，PCA方法能将在不同温度下炒制的麦芽分为4类，PLSDA分析表明炒制温度主要影响5羟甲基糠醛、丙烯酰胺等“无效成分”的含量，而对麦黄酮等“有效成分”的含量影响较小。同时，随炒制时间的延长，5羟甲基糠醛含量在2 min开始显著增加，16 min达到稳态，而丙烯酰胺在18 min时开始产生并持续增加；根据各成分的含量，HCA可将不同时间的炮制品及生品聚为5类。研究结果表明麦芽炒香过程中，“无效成分”的含量变化与炮制“火候”密切相关，而“无效成分”的动态变化规律可能为麦芽炒制工艺的评价以及功效机制阐释提供科学依据。

[关键词]麦芽；动态变化规律；无效成分；主成分分析；聚类分析

Dynamic change rules of active ingredients and inactive ingredients

from Fructus Hordei Germinatus with frying process

YANG Huasheng， TAN Lixia， WU Weigang， LI Xiaoli， WEN Lizhen， WU Lu*

（Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

[Abstract]It is not scientific to explain that fried Fructus Hordei Germinatus is more effective than row Fructus Hordei Germinatus in resolving food stagnation from the aspects of amylase， tricine and other "active ingredients" In the present experiment， the contents of active ingredients including quercetin， tricine， kaempferol， catechin， ferulic acid and inactive ingredients including 5hydroxymethyl furfural， acrylamide in frying process were determined by HPLC The dynamic change rules of active ingredient and inactive ingredients in the frying process were investigated by HCA， PCA and PLSDA analysis The results showed that the Fructus Hordei Germinatus samples with different frying temperatures were classified into 4 groups by HCA and PCA analysis PLSDA analysis showed that frying temperature mainly impacted the contents of inactive ingredients including 5hydroxymethyl furfural and acrylamide， with less effects on the contents of active ingredients Simultaneously， with the increase of time in frying process， the content of 5hydroxymethyl furfural was significantly increased from 2 min and became stable at 16 min， while the content of acrylamide was increased continuously from 18 min Based on the variation of the contents of various ingredients， samples at different frying time were classified into 5 groups The results showed that the content changes of "inactive ingredients" were closely related to the duration and degree of frying process， and the dynamic change rules of "inactive ingredients" can provide scientific basis for evaluating the frying process and elucidating the efficacy mechanism of Fructus Hordei Germinatus

[Key words]Fructus Hordei Germinatus； dynamic change rules； inactive ingredients； PCA； HCA

doi：10.4268/cjcmm20162315

麦芽为禾本科一年生草本植物大麦Hordeum vulgare L的成熟果实经发芽干燥而得，主要含有淀粉酶、蛋白酶等酶类成分，是中医临床常用的一味消食药；麦芽中还含有具抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性的麦黄酮、槲皮素、山柰酚、儿茶素、阿魏酸等成分[15]。麦芽一直沿用“炒黄炒香”入药的传统，北齐医学家徐之才有“麦芽能消食全在于炒”的论述，《药品辨义》中麦芽有“炒香开胃，以除烦闷”的记载。麦芽炒制时也多以上述“有效成分”作为评价指标。传统中医药理论及临床应用均表明，与生麦芽比较，炒麦芽的“消食化滞”作用更强。而现代研究表明，与生麦芽比较，炒麦芽中淀粉酶、蛋白酶的活性必然降低；同时，麦芽中的麦黄酮等有效成分的含量升高与“消食化滞”作用增强是否存在必然联系，仍缺乏相关报道。可见，仅从淀粉酶、蛋白酶、麦黄酮、槲皮素、山柰酚、儿茶素、阿魏酸等“有效成分”的角度并不能科学评价麦芽的炒制工艺。

近年来，中药炮制中时产生的Maillard反应产物（maillard reaction products，MRPs），如5羟甲基糠醛、丙烯酰胺等“无效成分”的活性引起广泛关注，本实验利用HPLC测定不同炒制程度麦芽样品中麦黄酮、槲皮素、山柰酚、儿茶素、阿魏酸5种“有效成分”及5羟甲基糠醛、丙烯酰胺2种“无效成分”的含量，利用聚类分析法（hierarchical cluster analysis， HCA）、主成分分析法（principal component analysis， PCA）对不同炒制程度的麦芽进行聚类分析，利用偏最小二乘判别分析法（partial least squaresdiscriiminate analysis， PLSDA）分析7种成分在麦芽炒香过程中含量的变化，以期为麦芽炒制工艺的评价以及功效机制阐述提供科学依据。

1材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪（G1311C四元泵，G4212B DAD检测器）；高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；水分测定仪（上海越平科学仪器有限公司）；非接触式红外测温仪（东莞万创电子制品有限公司）；电磁炉（杭州九阳生活电器有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

槲皮素（中国食品药品检定研究院，批号100081201509）、5羟甲基糠醛（中国食品药品检定研究院，批号111626200301）、丙烯酰胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号A108467）、阿魏酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号1506030）、山柰酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：A1619011）、麦黄酮（上海源叶生物科技有限公司，批号T05A7Z12520）、儿茶素（上海同田生物技术股份有限公司，批号15082731）。试剂甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他为分析纯。

生麦芽（产地安徽，批号150501，160417）购自亳州市佰世信中药饮片有限公司，经江西中医药大学付小梅副教授鉴定为禾本科植物大麦H vulgare的成熟果实，经发芽干燥而得。

2方法

215羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸含量测定方法的建立

211色谱条件Kromasil C18 （46 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇（A）1%冰乙酸（B），梯度洗脱（0～20 min，2% A，20～60 min，2%～445% A）；采用波长切换法，检测波长为283 nm（0～13 min），320 nm（13～17 min），283 nm（17～50 min），320 nm（50～60 min）；进样量20 μL；流速08 mL· min-1；柱温30 ℃。

212对照品溶液的制备精密称定5羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为018，066，0376 g·L-1的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇制成5羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸质量浓度分别为36，132，376 mg·L-1的混合对照品溶液。

213供试品溶液的制备取麦芽粗粉50 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50 mL，称定质量，超声提取40 min，放冷，再称重，用蒸馏水补足失重，摇匀，取2 mL溶液至离心管， 9 000 r·min-1离心2 min，取上清液，过滤，即得。

22槲皮素、麦黄酮、山柰酚测定方法的建立

221色谱条件Kromasil C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）1%冰乙酸（B），梯度洗脱（0～60 min，20%～35% A，60～70 min，35%～100% A），检测波长345 nm，流速08 mL·min -1，進样量20 μL，柱温30 ℃。

222对照品溶液的制备精密称定槲皮素、麦黄酮、山柰酚对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为096，0148，0736 g·L-1的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇制成槲皮素、麦黄酮、山柰酚质量浓度分别为96，148，5888 mg·L-1的混合对照品溶液。

223供试品溶液的制备取麦芽粗粉50 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，回流提取3 h后，过滤，挥干，用3 mL甲醇溶解，过滤，即得。

23丙烯酰胺含量测定方法的建立

231色谱条件Kromasil C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇水（2∶98），检测波长210 nm，流速05 mL·min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃。

232对照品溶液的制备精密称定丙烯酰胺对照品适量，加甲醇制成质量浓度1448 g·L-1的对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇制成质量浓度分别为1448，1448 mg·L-1对照品溶液。

233供试品的制备取麦芽粗粉20 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，称定质量，冰浴超声提取25 min，放冷，再称重，用蒸馏水补足失重，摇匀，取2 mL溶液离心，9 000 r·min -1，2 min，过滤，即得。

24炒制温度对麦芽中7种成分含量的影响

取同一批生麦芽，除去杂质，均分成10份，每份50 g，分别在90，120，140，160，180，200，220，240，260 ℃炒制，在炒制过程中用红外测温仪监测锅内温度，炒制时间均为20 min，得不同炒制温度及生麦芽样品，共10份，HPLC测定麦芽中7种成分含量，用水分测定仪测定样品含水量，计算相关成分的含量[6]。

25炒制动力学研究

取生麦芽，除去杂质，均分成13份，每份50 g，将其置于锅内，保持温度在220 ℃，在炒制过程中用红外测温仪监测锅内温度，待锅温达到220 ℃开始计时，炒制时间分别为2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，26 min，得不同炒制时间及生麦芽样品，共13份，HPLC测定麦芽中7种成分含量，用水分测定仪测定样品含水量，计算相关成分的含量。

3结果

315羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸方法学考察

在211条件下，各成分分离度良好，见图1。5羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸的标准曲线分别为y=11196x-0093 2（R2=0999 9），y=0721 8x （R2=0999 9），y=4852 3x+0267 6（R2=0999 9），定量范围分别为18～90，66～264，188～752 ng；精密度的RSD分别为14%，18%，20%，精密性良好；重复性试验的RSD分别为25%，22%，30%，重复性良好；稳定性试验的RSD分别为077%，21%，29%，表明供试品溶液在75 h内稳定；5羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸平均回收率分别为9782%，9760%，9816%，RSD分别为28%，29%，27%（n=6）。

1 5羟甲基糠醛；2儿茶素；3阿魏酸；A对照品；B样品。

32槲皮素、麦黄酮、山柰酚方法学考察

在221条件下，各成分分离度良好，见图2。槲皮素、麦黄酮、山柰酚的标准曲线分别为y=0987x+0667 （R2=0999 8），y=3868 4x+0544 4 （R2=0999 8），y=1443 9x+0634 4 （R2=0999 9），定量范围分别为48～1156，074～1776，294～7066 ng；精密度的RSD分别为050%，084%，073%，精密性良好；重复性的RSD分别为29%，27%，27%，表明重复性良好；稳定性试验的RSD分别为23%，23%，19%，供试品溶液在24 h内稳定；槲皮素、麦黄酮、山柰酚的平均回收率分别为9734%，1029%，1016%，RSD分别为24%，22%，16%（n=6）。

33丙烯酰胺方法学考察

在231条件下，成分分离度良好，对照品与样品色谱图见图3。标准曲线为y=12191x+5132 4（R2= 0999 9），定量范围在0724～11584 ng；精密度的RSD为091%，精密性良好；重复性的RSD为15%，表明重复性良好；稳定性见图4，表明麦芽样品溶液中的丙烯酰胺在15 h内稳定；加样回收率试验的平均回收率为9966%，RSD为20%（n=6）。

34炒制温度对成分含量的影响

341不同炒制温度的麦芽含量测定麦芽（批号150501）中7种成分及含水量结果见表1。由表1可知，“无效成分”5羟甲基糠醛、丙烯酰胺在不同的炒制温度下，含量變化较大，其RSD分别为166%，129%，表明炒制温度显著影响5羟甲基糠醛、丙烯酰胺等“无效成分”的含量，而传统“有效成分”中，阿魏酸由于热不稳定整体上表现为逐渐下降，而儿茶素、槲皮素、麦黄酮、山柰酚的含量变化相对较少，其RSD均少于20%。结果表明，炒制温度主要影响“无效成分”以及热不稳定性成分的含量，

而对热相对稳定的“有效成分”的含量影响较少。

342HCA分析以麦芽生品及炮制品中7种成分的含量为指标，利用SPSS 190软件，采用平方欧氏距离作为样品的测度，对10个样品进行聚类分析，结果见图5。结果10份样品可聚为4类。生麦芽和90 ℃炒制样品聚为一类，说明生麦芽与较低温度炒制时，7种成分的含量无明显差别，进一步表明炒制时温度不能太低。120，140，160，180，200 ℃5个温度下炒制的样品聚为一类，在此温度范围内，丙烯酰胺开始产生，但速度缓慢；220 ℃的样品单独聚为一类，相较于120～200 ℃的样品，其5羟甲基糠醛显著增加；240，260 ℃的样品，其5羟甲基糠醛、丙烯酰胺含量均较高，聚为一类。

343PCA，PLSDA分析在聚类分析的基础上，采用SIMCAP 115软件，以样品中7种成分含量为特征变量值进行PCA分析，以特征值大于1为提取标准，提取到2个主成分，以主成分矢量为坐标轴作图，见图6，所有炒制品均在95% 置信区间内，说明所有样本的总体特征基本一致；以样品的离散度分析，PCA亦分为4类，与HCA结果一致。

对这4类样品进行PLSDA分析，见图7。“无效成分”5羟甲基糠醛、丙烯酰胺在不同炒制温度的区分中具有较大的贡献率，而“有效成分”的贡献率较低。5羟甲基糠醛、丙烯酰胺均为Maillard的中间产物，研究表明，5羟甲基糠醛是具有一定的抗氧化、抗自由基、抗菌等作用[7]，其作用与麦芽的“消食化滞”作用可能存在相关性，而丙烯酰胺则是公认的毒性成分。PCA 和PLSDA 分析结果表明，麦芽炒制最显著的标记物为5羟甲基糠醛、丙烯酰胺，同时结合上述2种成分的作用，因此选择220 ℃为麦芽炒制温度。

35炒制动力学研究

351不同炒制时间的麦芽含量测定麦芽（批号160417）中7种成分及含水量结果见表2，图8。

由表2可知，“无效成分”丙烯酰胺、5羟甲基糠醛在炒制过程中，含量变化较大，其RSD分别为212%，77%。图8表明，在0～18 min，丙烯酸胺的含量为0或超出检测限，20 min后开始增加；在0～16 min内，5羟甲基糠醛含量持续增加，16 min后，含量基本保持不变；丙烯酰胺、5羟甲基糠醛均为Maillard反应的中间产物，根据丙烯酰胺、5羟甲基糠醛在炒制过程含量的变化规律，推测麦芽在炒制初期、中期发生了Maillard反应，其产物以5羟甲基糠醛为主，而炒制后期，其产物主要以丙烯酰胺为主。在炒制过程中，“有效成分”中儿茶素表现为先升高后降低，阿魏酸的含量呈现先降低后达到平衡的趋势，而槲皮素、麦黄酮、山柰酚含量变化不明显。

352HCA分析以麦芽生品及不同时间炮制品中7种成分的含量为指标，利用SPSS 190软件，运用平方欧氏距离作为样品的测度，对13个不同炒制时间样品进行聚类分析，结果见图9，生麦芽为一类，其中含有微量的5羟甲基糠醛，表明麦芽在干燥过程中可能会产生少量的5羟甲基糠醛，而本实验2批生麦芽中并无丙烯酰胺，表明丙烯酰胺多在温度较高的炒香过程中产生；2～4 min为一类，为炒制初级阶段，5羟甲基糠醛的含量随时间缓慢增加；6～14 min为一类，为炒制中级阶段，5羟甲基糠醛的含量随时间延长快速增加；16～18 min为一类，为炒制末期阶段，5羟甲基糠醛含量增加到最大值，但并没有产生丙烯酰胺；20～26 min为一类，丙烯酰胺开始产生，为麦芽炒制“火候”太过阶段。结合5羟甲基糠醛、丙烯酰胺的作用，麦芽炒制时间以16～18 min为宜。

4讨论

中药“炒香”过程中，由于热的作用，药材中的“有效成分”也会发生量和/或质的改变。“量”的变化与“有效成分”溶出量变化相关，“炒香”改变了药材的组织结构，降低了化学成分的扩散阻力，提高了溶出量，同时，热不稳定成分由于“热”的作用而发生降解而致溶出量减少；“质”的变化与新物质的生成或原物质的消减相关，因此，在中药“炒香”工艺研究中，多以“有效成分”量和/或质为评价指标。另一方面，药材中一些传统意义上的“无效成分”如糖、氨基酸、蛋白质等在“炒香”过程发生化学反应而产生新的的成分，在这些复杂的反应中，Maillard反应是近年来研究较多的反应之一，其MRPs多为具有挥发性的醛、酮，多为具有“香”味的物质，且具有一定的活性，因此仅从“有效成分”的角度并不能科学、全面阐述麦芽炒香后“消食化滞”作用较生麦芽更强的作用机制。近年来研究者开始逐渐关注药材中蛋白质、氨基酸、麦芽糖、葡萄糖以及炮制中产生的5羟甲基糠醛、丙烯酰胺等传统意义上的“无效成分”在“炒香”过程中的变化[814]。对麦芽而言，传统意义上的“无效成分”与“有效成分”并没有明显的界限，从“无效成分”的角度研究麦芽炒香的物质基础以及作用机制功效机制更具有科学性。实质上，对大多数中药来说，“香”的产生与“无效成分”之间更具相关性，因此，从“无效成分”的角度为研究中药“炒香”工艺及功效阐释提供了新的视角与方法。

本实验根据各成分性质，建立了麦芽中7种成分HPLC含量测定方法，并进行了方法学考查。采用波长切换法测定5羟甲基糠醛、儿茶素、阿魏酸的含量，以各成分的最大吸收波长为检测波长，提高灵敏度。

麦芽含有与“消食化滞”作用相关的淀粉酶、蛋白酶成分，酶的化学本质为蛋白质，其发挥作用的最佳温度为37 ℃，在麦芽炒制时，酶的活性必然下降，因此，本实验中没有考察炒制对麦芽中酶活性的影响，因此，进一步的实验将验证炒制对麦芽中酶活性的影响，并研究参与Maillard反应的还原糖、氨基酸等其他“无效成分”在炒制过程中的含量变化，以期进一步阐明炒麦芽“消食化滞”的作用机制。

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