邹良亮ZOU Liang-liang 康怀彬,2 -,2 张慧芸,2 -,2 谢安国,2 -,2 蔡超奇 - 王 波

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023;2. 食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳 471023)

高温肉制品是指加热介质温度高于100 ℃(通常为115～121 ℃)，中心温度高于115 ℃并恒定适当时间的肉制品。由于蒸煮温度较高，牛肉高温肉制品中细菌含量低甚至不含菌，产品保质期长更适合流通，并且具有营养卫生、携带方便等特点而深受消费者喜爱[1]。而在高温处理过程中蛋白质的变性、降解和氧化对牛肉制品最终的品质起着重要作用。目前国内外对于蛋白质降解的研究多集中在干腌火腿、风鸭等加工过程中的变化，如赵改名等[2]研究了金华火腿在加工过程中蛋白质及游离氨基酸的变化。热处理方面也主要集中于煮制条件在100 ℃以下的低温肉制品，如顾伟刚等[3]对3种猪肉汤体系中蛋白质降解产物进行了比较，戴研等[4]研究了欧姆加热对猪肉蛋白质降解的影响，但是对于蛋白质组分的变化却未有相关研究报道。

而对于高温肉制品，尤其是高温处理过程对牛肉蛋白质组分及其降解的影响尚未有过报道。因此本试验以不同处理温度及时间的牛背最长肌为研究对象，通过对其不同溶解性和不同结构蛋白质的含量，总氮、非蛋白氮、氨基态氮的含量，蛋白质水解指数以及全肌肉蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行研究分析，为牛肉高温肉制品的现代化工艺改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛背最长肌(取样前已排酸3 d)：夏洛莱公牛(18月龄)，河南伊赛牛肉股份有限公司；

三氯乙酸、磷酸氢二钠、溴酚蓝、异丙醇：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；

丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、N,N，-亚甲基双丙烯酰胺、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250、十二烷基磺酸钠(SDS)：分析纯，美国Sigma公司；

牛血清白蛋白、羟脯氨酸：分析纯，上海伊卡生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动凯式定氮仪：K9860型，济南海能仪器股份有限公司；

紫外可见分光光度计：V-LS-30型，尤尼柯上海仪器有限公司；

高速分散均质机：FJ-200型，上海标本模型厂；

高速离心机：H1650型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

稳压稳流型电泳仪：DYY-6C型，北京市六一仪器厂；

凝胶成像仪：Gel-Doc-XR+型，美国Bio-Rad公司；

高压蒸气灭菌锅：TYAIB型，宁波久兴医疗器械有限公司；

无线温度传感器：Ellab-TrackSense-Pro型，丹麦Ellab公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉样品的预处理及高温处理 顺着肉样纹理，将牛背最长肌中肉眼可见的表面脂肪、夹层脂肪剔除干净，并修整切割成大小均匀的方形肉块(5 cm×5 cm×1 cm)，用蒸煮袋真空密封包装，随后放入高压蒸气灭菌锅中进行高温处理。参考张莉莉[5]21的方法，高温处理条件为：高压蒸气灭菌锅压力0.12 MPa，当温度达到(110±1)，(115±1)，(121±1) ℃ 后分别保持3，6，9，12，15 min，高温处理后的牛肉样品静置冷却后放在4 ℃冰箱冷藏待测。

1.3.2 牛肉样品高温处理传热曲线绘制 高温处理过程中，牛肉样品中心温度参考张莉莉[5]22的方法，用无线Ellab-TrackSense-Pro温度传感器进行数据记录。

1.3.3 牛肉样品蛋白的提取

(1) 不同溶解性蛋白的提取：参照Visessanguan等[6]的方法，并作适当修改，称取1 g左右(精确至0.001 g)处理过的肉样，加入10倍体积pH 3.0盐酸溶液，10 000 r/min 均质1 min，6 500 r/min 冷冻(4 ℃)离心15 min，所得上清液即为酸溶性蛋白。另取1 g肉样，加入10倍体积预先冷却至4 ℃的提取液A(3.5 mmol/L磷酸二氢钠，15.6 mmol/L磷酸氢二钠，pH 7.0)，10 000 r/min均质1 min，6 500 r/min冷冻(4 ℃)离心15 min，此步骤重复2次，将上清液合并，沉淀备用。在上清液中加入50%三氯乙酸至终浓度为10%，6 500 r/min 冷冻(4 ℃)离心15 min，所得沉淀即为水溶性蛋白。在第1次离心所得的沉淀中加入10倍体积预先冷却至4 ℃的提取液B(3.5 mmol/L磷酸二氢钠，15.6 mmol/L 磷酸氢二钠，0.45 mol/L氯化钠，pH 7.0)，10 000 r/min 均质1 min，8 500 r/min冷冻(4 ℃)离心15 min，此步骤重复2次，上清液合并即为盐溶性蛋白。所得沉淀中加入10倍体积的0.1 mol/L氢氧化钠，6 500 r/min冷冻(4 ℃)离心15 min，上清液即为碱溶性蛋白。

(2) 不同结构蛋白的提取：参考Hashimo等[7]的方法，并作适当修改，称取1 g左右(精确至0.000 1 g)处理过的肉样，加入10倍体积20 mmol/L磷酸盐缓冲液(3.5 mmol/L磷酸二氢钠，15.6 mmol/L磷酸氢二钠，0.45 mol/L氯化钠，pH 6.5)，10 000 r/min均质1 min，10 000 r/min 冷冻(4 ℃)离心10 min，上清液即为肌浆蛋白。上述沉淀重新溶于30 mmol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液，10 000 r/min 均质30 s，10 000 r/min冷冻(4 ℃)离心10 min，除去上清液，沉淀溶于0.1 mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液，加入迭氮钠和碘化钾至最终浓度为0.02%和0.7 mol/L，10 000 r/min 冷冻(4 ℃)离心10 min，所得上清液即为肌原纤维蛋白。胶原蛋白的提取参照Eilert等[8]的方法，准确称取1 g肉样后加入9 mL 25%的Ringer溶液，10 000 r/min均质1 min，55 ℃水浴10 min，12 000 r/min冷冻(4 ℃)离心25 min，上清液即为胶原蛋白，此步骤重复3次。胶原蛋白含量测定参照GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定》，羟脯氨酸含量乘以9.75即为胶原蛋白含量。

1.3.4 蛋白质浓度的测定 采用考马斯亮蓝法。

1.3.5 总氮(TN)、非蛋白氮(NPN)、蛋白水解指数(PI)的测定

(1) 总氮：按GB/T 5009.5—2003执行。

(2) 非蛋白氮：参照赵改名等[3]的方法，并作适当修改，称取1 g左右(精确至0.000 1 g)肉样，加入10倍体积的15%三氯乙酸，10 000 r/min均质1 min，25 ℃静置1 h，6 500 r/min 冷冻(4 ℃)离心15 min，取上清液过滤。

(3) 蛋白水解指数：总氮用凯氏定氮法测定，非蛋白氮用微量凯氏定氮法测定，按式(1)计算蛋白水解指数。

(1)

式中：

PI——蛋白水解指数，%；

NPN——非蛋白氮含量，%；

TN——总氮含量，%。

1.3.6 氨基态氮含量的测定 按ZB X 66038—87执行。

1.3.7 全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳

(1) 全肌肉蛋白的提取：参考Bechtel等[9]的方法，称取1 g左右(精确至0.000 1 g)处理过的肉样，加入10 mL提取液(10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1% SDS，pH 7.0)，11 000 r/min 均质1 min，4 ℃静置1 h，10 000 r/min冷冻(4 ℃)离心15 min，所得上清液即为全肌肉蛋白溶液。

(2) SDS-PAGE电泳：采用Laemimli[10]的电泳体系，并参考姜启兴[11]50的方法，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 牛肉高温处理传热曲线

将牛背最长肌置于高压蒸气灭菌锅中，待温度分别达到(110±1)，(115±1)，(121±1) ℃时绘制高温处理传热曲线，结果见图1。在加热前20 min，牛肉中心部位温度急剧上升，并迅速接近至加热介质温度，升温速率不断增加。而在加热后期则升温速率明显变缓，可能是随着温度的升高，牛肉表面的蛋白质变性产生了不溶性的凝胶，阻碍了热量从牛肉表面向中心部位传递[5]23。

2.2 不同溶解性、不同结构蛋白质含量的变化

由表1可知，在原料牛背最长肌不同溶解性蛋白中，含量最高的为碱溶性蛋白，占7.13%，不同结构蛋白含量最高的是肌原纤维蛋白，为87.21 mg/g。水溶性蛋白含量在加热初期与原料相比显著降低(P<0.05)，并随温度的升高和时间的延长呈下降趋势，可能是由于水溶性的肌浆蛋白变性导致的。121 ℃加热15 min后，水溶性蛋白较原料下降了57.37%。

盐溶性蛋白含量的变化趋势与水溶性蛋白相似，与孙丽等[12]研究的蒸煮对金枪鱼蛋白质热变性的结果一致，可能是盐溶性的肌原纤维蛋白受热降解造成的。酸溶性蛋白含量随着加热时间的延长先下降后轻微上升，差异不显著(P>0.05)。碱溶性蛋白含量在110 ℃时，随着加热时间的延长而升高，而在115，121 ℃时呈先升高后下降、最后增加的趋势。碱溶性蛋白在加热后期含量增加主要是由肌浆蛋白和肌原纤维蛋白受热变性生成了不溶于水和盐溶液但溶于0.1 mol/L NaOH溶液的凝结物造成的。

† 同列上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量均随温度的升高和时间的延长而快速下降，121 ℃加热15 min后，肌浆蛋白含量下降了86.9%，肌原纤维蛋白含量下降了89.88%。肌浆蛋白和肌原纤维蛋白受热变性降解成小分子的蛋白质或多肽和游离氨基酸，从而导致了其含量急剧下降[13]。随着加热时间的延长，胶原蛋白含量先下降后基本保持平缓，加热初期下降主要是胶原蛋白随着加热温度的升高和时间的延长而降解成小分子蛋白，甚至进一步降解成明胶而溶出，而加热后期保持平缓是因为胶原蛋白全部变成了可溶性的胶原。Kong等[14]在研究鲑鱼时也发现，当加热到121.1 ℃时，90%的胶原已经溶出。

2.3 总氮、非蛋白氮及蛋白水解指数的变化

总氮、非蛋白氮及蛋白水解指数的变化可以客观地反映牛背最长肌在高温处理过程中蛋白质的降解，结果见表2。

牛背最长肌经高温处理后总氮含量显著升高(P<0.05)，并在110 ℃ 加热9 min时达到最大值(14.02%)。随着处理温度的升高，总氮含量呈下降的趋势，可能是由部分水溶性含氮物质溶解到渗出液中，或者部分挥发性含氮物的损失造成的。在高温处理初期非蛋白氮含量均显著升高(P<0.05)，加热6 min后变化不显著(P>0.05)。高温处理15 min后，110，115 ℃条件下的非蛋白氮含量相差不大。110，115 ℃时，非蛋白氮含量均先上升后下降，主要是因为游离氨基酸和多肽分子的聚集，其中水溶性氨基酸和肽类分子转移到渗出液中，使牛肉样品中非蛋白氮的含量降低[15]。在121 ℃时非蛋白氮含量先上升后下降再趋于平缓，与常亚楠[16]研究煮制条件对鸡腿中总氮和非蛋白氮含量影响的结果相一致。蛋白水解指数随加热温度的升高和时间的延长先升高后下降，牛背最长肌在加热初期蛋白水解指数变化显著(P<0.05)。高温处理9 min时，115 ℃条件下的蛋白水解指数比110，121 ℃ 条件下的都大，为4.58%；而在高温处理15 min时，121 ℃ 条件下的蛋白水解指数达到最大值(5.94%)。随着高温处理过程的不断进行，在加热后期蛋白水解指数呈下降趋势，可能是牛肉中水分活度不断降低、pH值发生改变以及离子浓度的升高阻碍了蛋白质的分解。

表2处理温度和处理时间对牛背最长肌总氮、非蛋白氮及蛋白水解指数的影响†

Table 2 Effects of different treatment temperature and time on TN, NPN and PI of beef longissimus dorsi muscle (n=3)

† 同列上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 氨基态氮含量的变化

不同高温处理后的牛背最长肌氨基态氮含量见图2。

Figure 2 Effects of different treatment temperature and time on content of amino nitrogen in beef longissimus dorsi muscle (n=3)

随着加热时间的延长，牛背最长肌中氨基态氮含量呈现上升趋势(P<0.05)，蛋白质水解作用不断增强。相同加热时间下，温度越高，氨基态氮含量越高，表明在较高的温度下，蛋白质的一级结构被破坏，蛋白质发生降解并且其肽键断裂，从而使得游离的氨基增多[17]。随着加热时间延长，氨基态氮含量呈现先平缓后上升后基本平衡的趋势(P>0.05)，110 ℃较115，121 ℃条件下增长趋势缓和，氨基态氮含量最终分别增加了0.015%，0.035%，0.037%。这与姜启兴[11]49研究鳙鱼肉加工特性时的结果基本一致，主要是因为牛背最长肌中含有较多大分子量的肌原纤维蛋白和胶原蛋白，而且肌纤维直径大密度小，受热冲击强烈，从而在加热过程中随温度的升高释放出更多的游离氨基。

2.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析

将不同高温处理后的牛背最长肌全肌肉蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果见图3。

由图3可知，随着处理温度的升高和加热时间的延长，牛背最长肌中蛋白质发生了降解聚集从而导致许多电泳条带消失以及新条带产生。结合图3(b)可知，加热处理后的牛背最长肌相较于生鲜牛肉的电泳条带，在200.0～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa条带范围内出现了明显的模糊变淡现象，表明蛋白质发生了高度降解。200.0 kDa的肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)随着加热温度的升高和时间的延长逐渐变淡，而在121 ℃加热时则完全消失，与Jiraporn Runglerdkriangkrai等[18]研究鱼丸高温杀菌时，发现116 ℃加热3 min时，MHC条带明显变浅，加热至6 min时则几乎完全消失的结果基本一致。而29.0～44.3 kDa的蛋白质只在加热初期发生了轻微降解，44.3 kDa的肌动蛋白在整个高温处理过程中都无明显的变化，表明肌动蛋白比肌球蛋白的热稳定性明显要高，与Tornberg等[19]在鸡肉加热过程中发现肌动蛋白电泳条带比肌球蛋白条带消失更慢的结果相一致。随着处理温度的升高和时间的延长，MHC电泳条带上部的颜色会加深，可能是高温使蛋白质发生了过度聚合变性，产生了聚集现象。

Figure 3 SDS-PAGE of proteins from beef longissimus dorsi muscle at different treatment temperature and time

3 结论

(1) 在高温处理过程中，牛背最长肌中的蛋白质高度降解，蛋白质组分发生了明显变化。水溶性蛋白和盐溶性蛋白均随加热温度的升高和时间的延长而急剧下降，胶原蛋白含量先下降后基本保持平稳。121 ℃加热15 min后，牛背最长肌中肌浆蛋白含量下降了86.9%，肌原纤维蛋白含量下降了89.88%。

(2) 随着加热时间的延长总氮含量呈先升高后降低的趋势，并在110 ℃加热9 min时达到最大值，为14.02%。加热温度对非蛋白氮和蛋白水解指数影响不显著(P>0.05)，而加热时间则对其影响显著(P<0.05)。随着加热时间的延长氨基态氮含量呈上升的趋势，110 ℃较115，121 ℃条件下增长趋势缓和，最终分别增加了0.015%，0.035%，0.037%。

(3) 牛背最长肌中200 kDa的肌球蛋白重链条带随着加热时间的延长逐渐变淡消失，并在200～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa条带范围内表现出明显的模糊变淡，而44.3 kDa的肌动蛋白在整个高温处理过程中均无明显的变化。

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