张 明 叶翠标

（1.廉江市石岭畜牧兽医站，广东廉江 524456；2.廉江市石城畜牧兽医站，广东廉江 524400）

鸡弓形虫诊断抗原的筛选探讨

张 明1叶翠标2

（1.廉江市石岭畜牧兽医站，广东廉江 524456；2.廉江市石城畜牧兽医站，广东廉江 524400）

鸡弓形虫诊断抗原的筛选对于鸡肉产品的质量控制、人弓形虫的防治有重要意义。ELSA是一种对鸡弓形虫感染筛查诊断技术，通过分离培养弓形虫，然后制作模型，能够获得足够量的弓形虫速殖子，提取速殖子全虫蛋白，而后虫蛋白后电泳，获得弓形虫的全虫蛋白，以此作为抗原进行Western blot，能够发现抗原，即敏感的蛋白条带，能基于该抗原的ELSEA方法，明确ELSEA最佳工作条件，评价诊断的敏感度。

鸡弓形虫；抗原；诊断

刚地弓形虫简称弓形虫或弓形体，是一种广泛寄生于人和动物原虫。弓形虫是一种血源性寄生虫，传播性强，感染率高，人感染力高达20～50%，可爆发性流行。鸡是弓形虫的重要中间宿主，在中间宿主体内以速殖子的形态进行无性生殖，可入侵大多数的有核细胞，以二分裂、内二芽、裂体增殖的方式进行不断的繁殖。在慢性病例中，可在脑、肌肉等处快速增殖形成包囊。感染弓形虫的鸡是人类感染弓形虫的主要来源，食用未经充分烹调，含有弓形虫包囊的鸡肉制品是人类感染弓形虫的重要原因。有报道显示，中国地区散养鸡的弓形虫感染率约为10～50%，感染防控不容乐观。对鸡进行弓形虫的诊断，有助于降低人感染弓形虫风险。本次研究尝试探讨探讨鸡弓形虫诊断抗原的筛选策略，为今后的研究提供依据。

1 鸡弓形虫感染诊断

弓形虫的感染诊断主要包括病原学诊断、核酸检测、免疫诊断等。病原学检查包括涂片或组织染色镜检，涂片检查主要针对病死动物的病料，处理时间长，有一定的特异性。动物或细胞接种实验是一种经典的监测方法，但敏感性较低，应用范围较狭窄，不适合大规模样本的抽查。分子生物学检查以聚合酶链式反应（PCR）为代表，具有敏感、特异、快捷的特点，可提取病料的DNA进行PCR扩增，监测弓形虫把基因片段，巢式PCR的敏感度较高，最低检出限18fg弓形虫DNA。血清学诊断包括染色实验、凝集实验、间接荧光抗体实验，面联免疫吸附实验等，其中ELSA方便、快速、成本低、高通量，应用广泛，其诊断弓形虫感染受包被抗原的不同，诊断的效率不同。最早出现的弓形虫ELISA诊断所使用的抗原为弓形虫速增殖子提取的天然蛋白，特异性并不理想，与其他许多疾病都存在交叉反应。目前同于弓形虫ELISA抗体诊断的抗原包被较多，包括速殖子粗提蛋白、速殖子表面抗原（SAG）、棒状体单板（ROP）系列、致密颗粒蛋白（GRA）系列等，在不同动物弓形虫检测的效果不尽相同，如SAG1在人类以及犬类感染的诊断中灵敏度较好。近年来对弓形虫抗原的研究不断深入，为诊断抗原的筛查创造了条件。

2 抗原筛选的思路

（1）需要获得分离保存的弓形虫，送实验室进行鉴定。进行培养，采用小鼠腹腔注射培养方法，向小鼠注射5×106数量级的弓形虫。饲养3日后断颈处死，采用生理盐水冲洗，收集含有弓形虫速殖子的腹水。收集得到的小鼠腹水，除弓形虫速殖外，还有大量的淋巴细胞，数量级会成本数量级上升。（2）需要去除收集腹水中的淋巴细胞，将腹腔冲洗液覆盖在等体积的淋巴细胞分离液上进行离心，速度2000r/min，持续20min，此时速殖子迅速沉淀，放弃所有的液体，采用生理盐水洗涤管底。显微镜下计数，速殖子需要占95%以上，纯化良好，-20℃冰箱下冬春。（3）需要建立鸡弓形虫感染的模型，具体方法是采用高锰酸钾熏蒸杀毒鸡舍，购买1日龄雏鸡，分笼饲养，饲养虫第2周龄开始，每只鸡107的剂量的纯化弓形虫纯化液与5%生理盐水配置成的输液10ml。（4）在第0～139日分别采集内脏血以及翅静脉血收集感染组以及对对照组的鸡血，36术°留置，离心，分装取血样。（5）提取速殖子全虫蛋白，将纯化后的速殖子生理盐水悬液进行血小板计数计算，离心，加入等量的水2×SDS-PAGE上样缓冲液，95%℃加热5min裂解速殖子，释放全虫单板。通过该注射器抽吸剪切力破碎剩余的速殖子以及蛋白提取液中的基因组DNA。95℃加热10min，溶解全虫蛋白并使单板与SDS结合变性。4℃下离心12000r/min，持续10min，按照说明书监测单板含量，封装冻存。获得全虫蛋白后，进行蛋白电泳，凝胶琼脂蛋白电泳，电泳完成后，凝胶染色，直至背景清晰，拍照留存，分析全虫蛋白的分布。（6）最后进行全虫蛋白的Western blot转录，采用离子水终止显色，拍照记录图片。

整个实验通过扩增、增殖采集血清样本，获得弓形虫的全虫蛋白，以此作为抗原进行Western blot，能够发现抗原，即敏感的蛋白条带，能够与感染弓形虫鸡的血清结合，从而诊断鸡的感染。在获得目标蛋白后，可进行蛋白切胶的回收、电泳分离鉴定，然后进行扩增合成，作为ELISA检验的包被抗原。然后采用正交试验，确认基于该抗原的ELSEA方法，明确ELSEA最佳工作条件，评价诊断的敏感度。

筛选ELISA检验鸡弓形虫监测的包被抗原并不困难，但实验的步骤较多，同时弓形虫的种类、感染情况、血样中的滴度也可能会影响抗原的筛查，需要确保足够的实验样本，选择有代表性的病株。

3 小结

鸡弓形虫诊断抗原筛查的工作量较大，理论上获得目标敏感单板作为包被进行ELISA的诊断，能够明显提高鸡弓形虫感染的诊断效率，减少费用。建立一套ELISA的诊断体系是一个系统性的工程，各个阶段都需要加强质控。

[1]刘守业，朱瑾莹.辽宁省大石桥地区蛋鸡弓形虫流行病学调查[J].现代畜牧兽医，2017，（8）：40-42.