金晓君

（建湖县近湖街道畜牧兽医站，江苏建湖 224730）

副猪嗜血杆菌病诊断方法研究进展

金晓君

（建湖县近湖街道畜牧兽医站，江苏建湖 224730）

副猪嗜血杆菌病快速敏感的检测技术不仅对于及时采取措施防控疫情蔓延等至关重要，还能及早发现新菌株，找出最危险的病原菌并开发相关疫苗，在防控疫情时掌握主动。用于诊断副猪嗜血杆菌病的方法有很多，其中有适合临床大批量血清检测的ELISA方法，ELISA具有操作步骤简单、敏感性高和特异性好等很多优点。

副猪嗜血杆菌病；诊断方法；研究进展

对于副猪嗜血杆菌病的诊断在很大程度上仍依赖于病原的分离与培养，这对于发现病情和及时诊断带来一定的困难。副猪嗜血杆菌的不同菌株可在一个猪场内流行和传播，从同一只猪身上，甚至在同一脏器内，可以分离出多株副猪嗜血杆菌。因此，临床诊断时无法鉴定出是哪一株副猪嗜血杆菌分离株是致病菌株。

1 病原学检测

根据临床症状、剖检病变进行细菌分离鉴定是副猪嗜血杆菌病的经典诊断方法。然而该菌培养条件苛刻，生长过程需要额外的NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），且很难从患病动物中分离到HPS，尤其是经抗生素治疗后，其分离更加复杂。

2 流行病学及临床症状

副猪嗜血杆菌只感染猪，主要存在于猪的上呼吸道（鼻腔、扁桃体和气管前段等）内，通过猪群间的接触和空气飞沫及污染物传播。临床上主要感染2～4月龄的猪，特别是5～8周龄的小猪，感染高峰见于保育期的4～6周龄。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行。主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、多关节炎和脑膜炎，心包积水，腹膜积水等。母源抗体和天然免疫对抵抗HPS感染很重要，在敏感猪群内，HPS引起的死亡主要发生在幼猪，有些猪群在断奶后1周就开始发病，这表明仔猪缺乏母源抗体保护力。当繁殖和呼吸综合症病毒（PRRSV）、圆环病毒2型（PCV-2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪流感病毒（SIV）感染后，几乎总是伴随着副猪嗜血杆菌感染，这已成为仔猪保育期死亡主要原因。近年来，还有从细菌性肺炎、化脓性支气管炎病变中分离到副猪嗜血杆菌，通常将此菌看作是继发性病原菌。根据病程的经过，大致可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型和隐性型5种类型，但所有这些类型可随条件的变动而互相转变，不能截然区分。最急性型：可表现为无症状突然死亡。

3 病理变化

剖检病死猪，可见胸腔出现纤维素性胸膜炎，腔内存在大量的淡红色液体及纤维素性渗出物凝块；腹腔内有多量透明黄褐色渗出液，有的呈胶胨状凝块。心包炎，心包积液，心包内有奶酪样或豆腐渣样渗出物，使外膜与心脏粘连在一起，形成“绒化心”；心肌有时有出血点。全身淋巴结肿大，呈暗红色，切面呈大理石样花纹；关节肿大，关节腔内有浆液性渗出性炎症，有不等量的黄色或淡红色液体，有的呈胶冻样。肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺呈暗紫红色，臌胀，有纤维素性渗出物覆盖在肺表面，有的肺与胸腔的侧壁粘在一起；支气管内有黄白色或淡红色泡沫样渗出物；肺间质灰白色到血样，胶冻样水肿是本病主要特征性病理变化之一。脾脏肿大，呈暗红色。肝脏肿大，表面有灰白色小坏死灶。肾脏肿大有少量出血点，肾盂有淤泥状物沉积。关节囊内有黏脓性红色渗出物，关节囊壁充血、出血、水肿。

4 毒力因子及诊断方法研究进展

副猪嗜血杆菌的毒力因子十分复杂，各毒力因子的作用机理及毒力因子之间的相互联系至今未被发现。近年来，人们作出许多尝试去鉴定Hps的毒力因子或毒力标记，已经提出有关Hps许多毒力因子的推测，包含细菌的菌毛，外膜蛋白，荚膜，脂多糖，神经氨酸酶，转运结合蛋白，hhdA和hhdB基因等。探索副猪嗜血杆菌致病性相关的毒力因子已经成为研究的热点和重点。在副猪嗜血杆菌毒力因子中，外膜蛋白是目前研究最多且成果显著的一个。Mcvicker等在副猪嗜血杆菌中发现了两个与流感嗜血杆菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5，该蛋白与细菌黏附有关，在毒力株和非毒力株中P2蛋白的大小有所不同，在毒力株中为48ku，在非毒力株中为55ku，可通过此项区分毒力株和非毒力株。目前，HPS实验室诊断应用最广泛的是PCR方法，其具有敏感性高、特异性好、稳定性强和快速的优点，可用于Hps感染的早期诊断和流行病学调查。刘建奎等针对HPS16SrRNA序列设计一段特异性引物，建立了快速准确鉴定HPS的PCR诊断方法。用于副猪嗜血杆菌血清学诊断方法ELISA检测方法具有操作简单、时间短、敏感性高，可用于大批量的抗原或抗体样品检测。王艳利用全菌作为包被抗原建立HPS抗体间接ELISA方法，具有较好的实验效果，石碧等提取HPS细菌荚膜多糖（CPS）作为抗原建立ELISA，具有很好的特异性。陈善真等利用表达纯化的外膜蛋白（P5）建立HPS抗体间接ELISA方法。贾爱卿、李鹏、李淼都利用表达纯化的HPSompP2蛋白作为抗原建立HPS间接ELISA方法。

4.1 病原学方法

一般认为，病原菌的分离鉴定是检测HPS的基本但较繁琐的方法。临床上从患病动物的培养物中很难分离到该病原菌，特别是经过抗生素治疗的患病动物，使得HPS更难分离和培养；加上HPS的菌落偏小，及复杂的生化试验鉴定等。所以，临床上HPS的分离、培养和鉴定的方法并不作为常规的诊断检测方法。目前，临床上使用免疫组化技术（IHC）从试验感染的临床病料可以分离鉴定HPS，但是采用此方法检测的多抗与淀粉样前体蛋白（APP）存在交叉反应，所以IHC技术临床意义上存在一定的局限性。

4.2 血清学方法

血清学方法因其特异性、快速和灵敏得到了广泛的应用。国内外已经建立起来的血清学方法主要包括间接血凝试验、琼脂扩散试验、补体结合试验、乳胶凝集试验等，其中补体结合试验可以检测HPS抗体滴度，存在一定的交叉反应；琼脂扩散试验是比较有效的方法之一，缺点是检测时间偏长。

4.3 分子生物学方法

随着生命科学的快速进展，在科研领域中，鉴于血清学方法存在波动性、不准确和不一致性，病原菌的检测中引入了新的分子生物学方法。目前，应用于HPS检测的分子生物学方法主要是针对DNA分子水平的检测，包括实时荧光定量PCR、常规PCR、原位杂交等检测方法，以及RFLP-PCR、REF、ERIC-PCR等新型的分子生物学方法可以鉴定不同血清型的病原菌。

5 诊断中的一些注意问题

由于HPS营养要求复杂，分离较为困难，需要在典型新鲜病料上采集、适宜的培养条件才能够提高其临床分离率，因此，在病料采集时，要选取临床症状典型且最好未经抗生素治疗的病猪，要尽快采取多个新鲜组织样品。同时应注意，仅从鼻腔、扁桃体或气管等组织脏器中分离细菌，是不能够确诊HPS，因为HPS是上呼吸道的共栖菌，应从内脏如心肺组织，心包液、胸膜积液，关节液、心血、脑脊液等处进行病原分离。

6 结语

副猪嗜血杆菌病在病毒性疫病感染后继发感染或与其他疫病混合感染，使猪群的病情复杂化，病死率增加，给全世界养猪业造成了巨大经济损失。本病没有很好的治疗措施，只能以预防为主，采取综合措施加以防控。迄今为止，已对HPS进行了一系列的研究探索，取得了许多显著的成就，同时也存在很多难题，相当一部分的临床分离株并不难具体的血清型定型，HPS的感染分子机制并不清楚，以及一些常规的检测HPS的方法也存在一定的局限和困难。这些难题都需要科研工作者深入研究，以便更加了解HPS和寻找到更好的诊断治疗方法。

[1]陈善真.副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立[D].华南农业大学，2010.

[2]谷禹.天津地区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查及其防治措施的制定[D].吉林大学，2016.

[3]张岩.石河子垦区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查研究[D].石河子大学，2013.