张业翠，吴鹏，武文，郭兴莹，王艳青，黄象艳

(济南军区总医院， 济南 250031)

ABO正反定型不符患者血型的血清学及基因测序鉴定(附1例报告)

张业翠，吴鹏，武文，郭兴莹，王艳青，黄象艳

(济南军区总医院， 济南 250031)

目的对1例ABO正反定型不符患者血型进行血清学及基因测序鉴定。方法选择1例标准血型血清学方法(微柱凝胶卡+全自动血型配血分析仪)鉴定结果为ABO正反定型不符(正定型为O型，反定型为A型)患者，抽取其血液标本，采用试管法做进一步的血清学鉴定，包括正反定型复查、红细胞吸收放散试验；提取血液基因组DNA，采用PCR法扩增ABO基因第6、7外显子并测序。结果试管法血清学表现为ABO血型正反定型不一致,正定型未检测到A抗原和B抗原,反定型血清中存在抗-B及弱的抗-A；红细胞做吸收放散试验检出A抗原，初定为A亚型。测序结果与A101参考序列相比较，发现Ax13亚型940位碱基A>G的亚型决定性基因突变。结论本例患者ABO血型疑似A亚型，ABO基因型为Ax13/O01，第七外显子940位A>G突变导致A抗原表达减弱。

ABO血型；Ax13亚型；基因测序；基因突变

血型是指血液成分(包括红细胞、白细胞、血小板)表面的抗原类型，是血液中各种成分的遗传多态性标志，通常所说的血型是指红细胞膜上特异性抗原类型。国际输血学会已经在人类中正式报告了属于36个血型系统的300多种红细胞抗原[1]。ABO血型是临床输血医学中最重要的红细胞血型系统之一，涉及临床安全输血、器官移植、医学遗传学等领域[2]。ABO血型系统除正常的 A、B、O、AB这4 种血型外，还具有多个亚型，表现为抗原明显减弱或正反定型不一致。ABO亚型的主要发生原因是ABO基因编码区的突变，包含点突变、缺失突变等[3]。对于常规血清学检测不能确定的血型，应该行ABO基因测序分型。本研究采用标准血清学鉴定和ABO基因测序的方法鉴定1例血清学实验正反定型不符的疑难血型标本，并分析Ax亚型的血清学特征和基因序列特征。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者男，34岁。体外受精术前采用标准血型血清学方法(微柱凝胶卡+全自动血型配血分析仪)鉴定血型，结果为ABO正反定型不符(正定型为O型，反定型为A型)。本研究已获我院医学伦理委员会批准。患者对本研究知情同意且已经签署知情同意书。

1.2 ABO血型血清学鉴定方法 ①试管法ABO正反定型[4]：取洁净小试管6只，标明抗-A、抗-B、AC、BC、OC、自身C，标记有抗-A、抗-B字样的小试管分别加入抗A、抗B标准血清各1滴及被检者5%三洗红细胞生理盐水悬液各1滴；标记有AC、BC、OC字样的小试管分别加入相应的5%试剂ABO细胞各1滴及被检者血清各2滴，标记有自身C字样的小试管加入被检者5%三洗红细胞生理盐水悬液l滴及血清2滴，以上各管均充分混匀，放入血型血清学专用离心机以1 000×g离心15 s，判读结果。②红细胞吸收和放散试验：取患者三洗压积红细胞1 mL，加等量单克隆抗-A试剂混匀，置于4 ℃环境中吸收1 h ，然后用冷盐水洗涤8次，再加等量常温的生理盐水混匀，放入56 ℃热放散10 min后离心取放散液。用低离子抗人球卡将放散液与A试剂红细胞反应，并将最后一次离心洗涤后的上清液作为平行对照，孵育离心观察结果。

1.3 ABO基因测序方法 抽取患者外周静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中, 使用TIANamp血液DNA提取试剂盒, 按步骤提取全血DNA，用外显子6、7扩增试剂盒和PCR法扩增ABO基因外显子6和7，将PCR产物送上海生工生物工程公司进行直接测序。将测序结果与红细胞基因序列数据库中的ABO等位基因进行比对，确定亚型。

2 结果

2.1 血清学鉴定结果 试管法复查血型，室温条件下结果与微柱凝胶法结果一致。正定型患者红细胞与抗-A、抗-B标准血清均无凝集；与抗-AB反应凝集强度为++；与抗H反应凝集强度为++++；反定型患者血清与标准反定细胞AC、OC均无凝集，与BC凝集强度为++++，自身对照为阴性。反定型放4 ℃ 10 min后立即离心，结果显示血清中除检出有较强的抗-B外，还检出弱的抗-A(凝集强度为+/-)；4 ℃ 30 min后再次离心抗-A凝集强度较前有所增强(凝集强度为++)。血清学格局呈现A亚型。吸收放散试验放散液与A试剂红细胞呈阳性反应，最后一次离心洗涤后的上清液与A试剂红细胞呈阴性反应。

2.2 基因测序结果 外显子6存在261位缺失突变，为O01型一般性特征性突变；外显子7出现第940位A>G突变，为Axl3亚型决定性突变。结合外显子6和外显子7测序结果，确定受检标本的基因型为Axl3/O01。

3 讨论

正确的血型鉴定是保证临床输血安全的关键。因此，如何正确鉴定常规血清学检测中正反定型不符的血型标本至关重要。ABO亚型是引起血型正反定型不符的常见原因之一，其判定标准往往是根据红细胞和抗体反应强度、H抗原强度、吸收放散能力等进行[5]。本研究该例患者血清学实验显示为A亚型，血清学检测结果显示为疑似Ael亚型或Ax亚型。Ax亚型是ABO亚型中一种弱表现型，Ax表现型具有高度的遗传异质性，其主要血清学特征是: Ax亚型红细胞与来源于B型个体血清中的抗-A呈弱凝集反应或不凝集，与来源于O型个体血清中抗-AB的反应增强，血清中常含有弱的抗-A，与抗-H的凝集强度都近似于O型，显示强凝集[6，7]。Ax亚型与Ael亚型有相似之处，Ael 亚型是另一种较为罕见的ABO亚型，其红细胞通常条件下与抗-A、抗-AB血清试剂不发生凝集，H抗原的含量比B型红细胞高，接近O型红细胞，A抗原表达量极弱，往往需要通过吸收放散试验才能检出[8，9]。本研究中该例患者血清学实验结果显示红细胞与抗AB凝集++，与抗H凝集++++，经吸收放散试验检出A抗原；反定型在4 ℃10 min检出较强的抗-B及弱的抗-A，4 ℃ 30 min后抗-A凝集强度较前有所增强凝集强度为++，推测该血型可能为Ax亚型。由于Ax亚型与Ael亚型之间只表现为极少的血型血清学差异,为进一步确定该患者亚型，我们对ABO基因进行测序以确定其亚型。

ABO血型系统基因位于9号染色体，由7个外显子和6个内含子组成，其中ABO基因型多态性集中在6、7外显子片段。所以我们对ABO基因第 6、7 外显子和第6 内含子的核苷酸序列进行了测序。结果显示，外显子6存在261位缺失突变，为O01型一般性特征性突变；外显子7出现第940位A>G突变，经检索国际血型抗原突变库，940位A>G突变基因为Axl3[10]，940位碱基突变只有在Axl3等位基因中发现。α1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因940位A>G突变使314位赖氨酸变成谷氨酸，进而导致A抗原表达减弱。自从1993年报道了世界首例Ax等位基因[11]以来，在不同地区和人群中陆续发现25个Ax等位基因，Cai等[12]在2013年报道了Axl3等位基因。突变导致的A抗原弱表达易使弱A错判为O型，造成血型鉴定错误。

血型鉴定在输血工作中占有极其重要的地位，是输血治疗的首要步骤。除此之外，ABO血型在心血管疾病中的风险相关性研究[13]和与肿瘤患者预后相关性的研究[14]也越来越受到关注。因此，血型鉴定的准确与否是临床输血安全和其他临床相关研究最为关键的一步。除了常见的典型ABO表型外，已经发现许多ABO亚型在红细胞上具有弱表达的A或B抗原，这使得血型分型越来越困难，往往呈现ABO正反定型不一致。遇到ABO正反定型不符的标本，首先需要通过重新采集血样和重复规范操作来排除操作不规范等因素的影响，然后需要通过实验排除弱抗原和(或)弱抗体的漏检，找到科学合理的解释，最终通过血清学特征初步判定血型。

血清学方法是血型鉴定的经典方法，适用于日常的血型定型工作。当遇到血型正反定型不一致时，可以通过敏感的吸收放散试验和血型物质检测证实抗原的存在，通过4 ℃加强试验证实抗体。当然，在亚型鉴定时仅采用血清学方法鉴定是有一定局限性的，同样是A亚型，在基因测序时就有可能会出现Ax、Ael等不同的基因型或同一亚型的不同分型。基因测序可以对患者血型进行基因分型，并有可能发现新的突变位点、探讨疑难血型的发生机制，是对血清学鉴定方法的有效且重要的补充[10]。因此，在血型鉴定工作中将两种方法有效结合，对于正确鉴定疑难血型和保证临床安全输血具有重要意义。

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黄象艳(E-mail： xiangyan73@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.013

R446.6

B

1002-266X(2017)40-0048-03

2017-04-30)