高同国++姜军坡++郭晓军++张冬冬++朱宝成

摘要：为获得对马铃薯疮痂病（potato scab）病原菌具有较强拮抗作用的优良菌株，以笔者所在实验室保存的237株细菌为出发菌株，采用十字交叉划线法和平板扩散法进行初筛和复筛。经筛选后得到1株拮抗活性明显的菌株 12-82，其抑菌圈直径达26.2 mm。经菌落菌体形态观察、16S rRNA基因序列分析及生理生化试验，将菌株12-82初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），该研究为开发防治马铃薯疮痂病的生物菌剂奠定了基础。

关键词：马铃薯疮痂病；生物防治；解淀粉芽孢杆菌；菌种鉴定；生物菌剂

中图分类号： S435.32文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0157-03

收稿日期：2015-11-17

基金项目：河北省自然科学基金（编号：C2015204031）。

作者简介：高同国（1984—），男，河北邢台人，博士，讲师，主要从事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：gtgrxf@163.com。

通信作者：朱宝成，博士，教授，博士生导师，主要从事微生物发酵秸秆饲料研究。E-mail：baochengzhu@126.com。

马铃薯种植区域广泛，仅次于水稻、小麦和玉米。近年来，马铃薯疮痂病（potato scab）的发生逐渐加重，已成为马铃薯主要病害之一。该病主要由链霉菌引起，可危害马铃薯块茎，感病的薯块表面形成痂状病斑，影响马铃薯的外观品质，从而降低薯块的商品价值[1-2]，严重时还会延迟马铃薯出苗，甚至减少产量[3]。在我国，引起疮痂病的病原菌有疮痂链霉菌（Streptomyces scabies）、酸性疮痂链霉菌（S. acidiscabies）、肿痂链霉菌（S. turgidiscabies）和加利利链霉菌（S. galilaeus）等多种病原菌[4-5]。

目前缺乏有效手段防治马铃薯疮痂病，而利用生物防治方法越来越多地引起人们的重视。Beauséjour等利用生物制剂与壳聚糖结合用于防治疮痂病取得良好效果[6]。Neeno-Eckwall等在田间试验中使用S.diastatochromogenes PonSSII防治疮痂病，症状明显减轻[7]。Hiltunen等报道利用非致病性链霉菌也可以防治疮痂链霉菌[8-10]。刘大群等采用生防拮抗链霉菌防治马铃薯疮痂病，结果表明，不同的菌系有明显的防效差异，单个拮抗菌的防效优于2个拮抗菌的混合使用效果[11]。另外，利用微生物代谢产物防治疮痂病也是有效手段之一，Han等报道利用芽孢杆菌产生的代谢物macrolactin A有效地防治马铃薯疮痂病，使疮痂病的发病率降低了40%[12]。

本研究以疮痂病病原菌疮痂链霉菌作为指示菌，从笔者所在实验室保存的237株细菌中筛选对疮痂病有拮抗作用的菌种，并通过菌落菌体形态特征、16S rRNA基因序列和生理生化特性对拮抗活性较强的菌株进行鉴定，该研究以期为马铃薯疮痂病的生物防治提供理论基础。

[BT1#]1材料与方法

1.1试验菌株

马铃薯疮痂病病原菌：疮痂链霉菌，来源于河北农业大学植物保护学院植物病理实验室。237株细菌来源于河北农业大学生命科学院制药工程系。

1.2供试培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15.0～20.0 g，加H2O至1 L，pH值7.0～7.2；NA培养基中不添加琼脂为NB培养基；燕麦琼脂培养基（OMA）：琼脂18.0 g，加2%燕麦汁至1 L，调pH值至7.2。以上培养基在121 ℃高压灭菌30 min。

1.3方法

1.3.1制备病原菌孢子悬浮液

将病原菌接种于OMA固体培养基中，置于28 ℃培养箱中培养3～5 d。取10 mL无菌水于长满疮痂病病原菌的培养皿中，用玻璃棒轻刮培养物表面的孢子，再用装有脱脂棉的5 mL无菌注射器筒过滤除去菌丝团，滤液倒入离心管中，4 ℃、6 000 r/min离心15 min，使孢子沉淀，离心完毕后倒掉上清，将离心管在漩涡混合器上振荡，使孢子沉淀物分散于残存的无菌水中。在无菌条件下，将制备好的菌种用无菌水稀释，孢子悬浮液的浓度不低于 107 CFU/mL。

1.3.2拮抗菌筛选

初筛：取100 μL孢子悬浮液均匀涂抹在OMA平板上，将已活化的待筛选菌种以十字划线方式接种于培养皿中。28 ℃培养7 d，观察抑菌圈的大小。

复筛：将NA培养基上活化好的待筛选细菌接种于NB培养基，37 ℃、200 r/min发酵48 h，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，并经细菌滤器（0.22 μm）过滤，即得无菌发酵液，待用。取100 μL孢子悬浮液均匀涂抹在OMA平板上，将培养皿平均分为4个扇形区域，在扇形中央用打孔器打1个直径6.0 mm的孔，用移液器取50 μL无菌发酵液滴于孔内，28 ℃培养7 d，测量抑菌圈的直径（mm）。每处理重复3次。

1.3.316S rRNA基因PCR扩增

用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）提取菌株的总DNA[13]，选用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增。正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。25 μL PCR反应体系：DNA模板2 μL，10×缓冲液2.5 μL，正向引物与反向引物各0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR结束后，采用1%琼脂糖凝胶对PCR结果进行检测，并交华大基因进行序列测定。将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已知的核酸序列进行BLAST比对，获得相近属种菌株序列，利用ClustalX 1.83、MEGA 5软件构建 Neighbour-Joining系统发育树。

1.3.4形态学与生理生化鉴定

将优良拮抗细菌菌株接种于NA培养基上，30 ℃培养24 h，观察菌落形态并经革兰氏染色后镜检。参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]，采用细菌微量生化反应管对硝酸盐还原、大分子利用、酶类利用以及耐盐性等生理生化指标进行测定。

2结果与分析

2.1对马铃薯疮痂病菌的抑菌效果

从237株细菌中筛选得到4株对病原菌抑制效果较好的菌株，分别为3011、Z-6、12-82、12-34（图1），其中菌株 12-82抑菌活性最强，抑菌圈直径达26.2 mm。

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2.2菌落、菌体形态

拮抗菌株12-82在NA培养基平皿上生长良好，菌落形态呈圆形或近圆形，略隆起，乳白色，不透明，表面光滑，无色素产生，延长培养时间发现，菌落干燥，有褶皱及突起，边缘不整齐（图2-A）。在光学显微镜下观察发现，经革兰氏染色后的拮抗细菌12-82菌株的菌体呈杆状（图2-B）。

2.3总DNA提取和16S rRNA基因扩增结果

进一步采用16S rRNA基因对拮抗细菌12-82进行分子水平鉴定。首先采用CTAB法提取细菌的总DNA（图3），表明该DNA可用于PCR扩增。

用16S rRNA基因通用引物27F、1492R对菌株12-82总DNA进行PCR扩增，扩增结果具有单一特异性条带（图4），可直接将PCR产物送华大基因进行测序。

以菌株12-82的总DNA为模板，PCR 扩增得到该菌株1.5 kb左右的基因片段，测序后提交GenBank获取登录号（KT247502），经BLAST比对获取若干同源序列。用 MEGA 5 构建系统发育树（图5），可见菌株12-82与Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42的亲缘关系最近（9778%）。

2.4生理生化试验结果

根据菌落菌体形态及16S rRNA基因鉴定结果，对菌株12-82的生理生化性质进行测定。从表1可见，菌株12-82经动力试验、伏-普反应（Voges-Proskauer reaction，简称 V-P反应）、接触酶、糖类发酵、硝酸盐还原、酪素水解、柠檬酸盐利用、明胶水解、淀粉水解等反应均为阳性，甲基红、丙二酸盐反应均为阴性，与已报道的解淀粉芽孢杆菌性质一致。

综合菌株12-82的形态特征、16S rRNA基因序列及菌株[CM（25]的生理生化特性，对照《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌系统鉴定手册》，鉴定拮抗菌12-82菌株属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3讨论

马铃薯疮痂病是难以防治的世界性土传病害，目前缺乏防治该病害的有效手段，而生物防治已成为防治植物病害的有效手段，芽孢杆菌因营养简单、繁殖速度快、可产生内生芽孢、抗逆能力强、易定殖等优点而逐渐成为世界生物防治的重点。郭凤柳等对从土壤中分离的对疮痂病病原菌具有拮抗活性的菌株B1进行了鉴定，菌株B1属于枯草芽孢杆菌[16]。李勇筛选出1株对疮痂病有抑制作用的枯草芽孢杆菌ZWQ-1，其抑菌带宽度最高为18.75 mm[17]。除上述报道外，国内关于疮痂病生物防治的报道较少。

本研究从笔者所在实验室保存的237株细菌中筛选获得1株对疮痂病病原菌疮痂链霉菌具有较强拮抗作用的菌株 12-82，其抑菌圈直径达26.2 mm。经形态观察、16S rRNA基因序列分析及生理生化试验，初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究增加了国内研究马铃薯疮痂病生防菌株资源，为菌株12-82抑菌机制研究及应用奠定了基础。

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