郑蓓,耿惠,李双,刘立,孙朝君,刘玉洁(青海大学，西宁8000；青海大学附属医院；沧州市人民医院；淄矿集团中心医院)

高原低氧条件下大鼠铁代谢及其相关因子表达的变化

郑蓓1,耿惠2,李双1,刘立1,孙朝君3,刘玉洁4
(1青海大学，西宁810001；2青海大学附属医院；3沧州市人民医院；4淄矿集团中心医院)

目的 探讨高原低氧条件下大鼠铁代谢及其相关因子表达变化。方法 选取雄性SD大鼠50只，将大鼠分别在低氧环境[低压氧舱(模拟海拔5 000 m)饲养]下饲养7、15、30 d(低氧7 d、15 d、30 d组),常氧条件下[西宁地区(海拔2 260 m)饲养]饲养7、15、30 d(常氧7 d、15 d、30 d组)。分别于饲养7、15、30 d测定大鼠外周血血常规、血清铁(SI)、血清铁蛋白(SF)水平，qRT-PCR 和Western blotting法测大鼠肝组织铁调素(Hepc)、膜结合型铁调素调节蛋白(m-HJV)、Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS6)及肌肉组织可溶型铁调素调节蛋白(s-HJV)mRNA和蛋白表达量，qRT-PCR和ELISA法测大鼠肝脏Hepc mRNA和蛋白表达量。结果 低氧7 d、15 d、30 d组大鼠血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)、SF水平均高于常氧同时间组(P均<0.01)，低氧30 d组 SI水平高于常氧同时间组(P<0.05)，随着缺氧时间延长Hb、HCT、SI、SF水平逐渐升高(P均<0.05)。低氧15 d、30 d组肝组织Hepc mRNA及蛋白表达量均低于常氧同时间组(P<0.01或<0.05)，且随着缺氧时间延长其表达水平逐渐降低(P均<0.01)。低氧各组间组大鼠肝组织m-HJV mRNA及蛋白表达量均低于常氧同时间组(P均<0.01)，随缺氧时间延长m-HJV逐渐降低(P均<0.01)。低氧各时间组大鼠肌肉组织s-HJV mRNA及蛋白表达量、肝组织TMPRSS6 mRNA及蛋白表达量均高于常氧同时间组(P均<0.01)，且随着缺氧时间延长表达量逐渐升高(P均<0.01)。结论 高原低氧条件下，大鼠肝组织TMPRSS6表达量升高，可能裂解m-HJV成为s-HJV，使Hepc转录受抑制，最终导致SI水平升高。

铁代谢；铁调素；铁调素调节蛋白；Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶；低氧；大鼠

铁调素(Hepc)是由肝细胞生成的小分子多肽，促进铁输出蛋白膜铁转运蛋白(FPN)的内化和降解，通过限制膳食铁的吸收和巨噬细胞储存铁的释放调节铁平衡[1]。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS6)和铁调素调节蛋白(HJV)是目前已知的在调控Hepc中发挥重要作用的两个上游调节基因。TMPRSS6是一种主要在肝脏表达的新型嵌合酶，于2002年首次被识别。TMPRSS6可下调Hepc的表达，且以此方式增加血清铁(SI)水平。TMPRSS6在低氧条件下被上调，这给低氧和铁稳态提供了新的联系[2]。HJV是由位于1q21的染色体HJV基因编码产生的，在肝脏、骨骼肌和心脏高度表达，在细胞内铁的吸收和释放方面有重要作用[3]。HJV是骨形态发生蛋白(BMP)受体的共受体，通过Smad信号通路调节Hepc的表达[4]。HJV在哺乳动物中以膜结合和可溶性形式存在，膜结合型HJV(m-HJV)主要在肝脏表达，可溶型HJV(s-HJV)主要在骨骼肌及血清中发现，且m-HJV和s-HJV对Hepc的调节是竞争性抑制的。国内外有研究认为在高原低氧状况存在Hepc调节的改变，尚无具体Hepc调节改变的机制研究。2015年10月～2017年1月，本课题组通过模拟高原不同暴露时间，探讨低氧状态下大鼠SI、血清铁蛋白(SF)，肝组织Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉组织s-HJV表达的变化，以进一步揭示慢性高原病(CMS)铁代谢发生变化的相关机制，为CMS的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：雄性健康SD大鼠50只，体质量180～200 g，由西安交通大学第一附属医院动物所提供，动物合格证号：scxk(陕)2012-003。TRIzol RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司，TIANGEN Script RT 试剂盒及Super Real PreMix Plus(SYBR Green)购于Tiangen公司。Hepc、m-HJV、TMPRSS6、s-HJV引物购于美国Invitrogen公司，SI及SF试剂由西门子公司提供。Hepc ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物处理和实验分组 选取50只健康雄性SD大鼠，从西安运到西宁，适应1周后进行实验。将大鼠随机分为低氧组和常氧组，西宁地区(海拔2 260 m)饲养7、15、30 d各8只(常氧7 d、15 d、30 d组)，低压氧舱(模拟海拔5 000 m)饲养7 d 8只、15 d 9只及30 d 9只(低氧7 d、15 d、30 d组)，两组动物饲养环境基本一致。分别于饲养7、15、30 d收集外周血及肝脏、肌肉标本备检。

1.3 血常规及血清SI、SF的检测 腹腔注射20%乌拉坦(1 mL/200 g体质量)麻醉大鼠，腹主动脉取血行血常规检测；另取全血提取血清后放于EP管中，加封口膜，保存于-80 ℃冰箱，用比色法测SI及免疫发光法测SF。

1.4 肝组织m-HJV、TMPRSS6及肌肉组织s-HJV蛋白表达量的测定 采用Western blotting法。麻醉大鼠后，处死，并取远离肝血管窦部肝组织及大鼠腓肠肌长头组织，迅速放入液氮罐中待测。称取50 mg肝脏/肌组织，按照1∶10的比例加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上，充分研磨至组织完全裂解，将研磨皿底部液体吸至1.5 mL EP管内，裂解30 min；4 ℃、14 000 r/min离心20 min，收集上清液，即为总蛋白。取少量上清进行蛋白定量，其余部分加入Loading Buffer液，104 ℃煮30 min，后置于-20 ℃保存备用。再经制胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显色，曝光采集图像。目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值。

1.5 肝组织Hepc蛋白表达量的检测 采用ELISA法。取待测肝组织50 mg,严格按照试剂盒说明书步骤进行试验操作,酶标仪测量各孔OD值，绘制标准曲线，根据标准曲线的方程计算待测样本的表达量，乘上稀释倍数，即可算出待测样本实际的表达量。

1.6 肝组织Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉组织s-HJV mRNA表达测定 采用qRT-PCR 法。将50 mg肝脏/肌肉织迅速放入已加入1 mL TRIzol的EP管中，行匀浆处理(持续匀浆不超过10 s),室温静置5 min，再经过离心、各相分离、RNA沉淀、RNA漂洗、无水乙醇沉淀及RNA溶解，测定RNA浓度和RNA质量，用紫外分光光度仪测定OD比值(A260/A280)。琼脂糖凝胶电泳跑胶、紫外线下观察条带并成像。基因引物碱基序列：hepcidin上游引物：5′-GCCTGTCTCCTGCTTCTC-3′，下游引物：5′-TCTGTCTCGTCTGTTGCC-3′;HJV上游引物：5′-GTCCTCTTTGTTCTGTGGTTT-3′，下游引物：5′-GGTCGTTGTCTCCTGTCC-3′;TMPRSS6上游引物：5′-CTTCACTTCCAACCCTTT-3′，下游引物：5′-TTACTTTCCCACAGACCTT-3′;β-Actin上游引物：5′-CCTAGAACTTCGAGCAAGAGA-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。试验在ABI7500荧光实时定量PCR仪上进行，每个样品设3个重复孔，每组样品重复1次。PCR反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40个循环，用ABI7500软件采集并分析数据。基因相对表达量运用2-ΔΔCt法计算。

2 结果

2.1 各组血清血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)及SI、SF水平比较 低氧7 d、15 d、30 d组血清Hb分别为(205.38±9.18)、(231.67±11.37)、(259.67±12.13) g/L，血清HCT分别为66.69%±3.51%、68.74%±2.96%、76.36%±3.68%，SI分别为(35.18±8.60)、(41.37±8.82)、(41.67±9.77)μmol/L，SF分别为(78.9±18.85)、(88.10±29.49)、(97.13±40.70)μg/L；常氧7 d、15 d、30 d组分别为(169.88±6.83)、(175.25±4.65)、(188.75±6.20) g/L，54.04%±1.74%、51.46%±1.15%、54.84%±1.81%，(31.29±4.23)、(39.48±6.95)、(38.91±6.32)μmol/L，(31.58±11.4)、(47.01±7.56)、(60.40±15.27)μg/L。低氧7 d、15 d、30 d组大鼠血清Hb、HCT及SF水平均高于常氧同时间组(P均<0.01)，低氧30 d组 SI水平高于常氧同时间组(P<0.05)，随着缺氧时间延长Hb、HCT、SI、SF水平逐渐升高(P均<0.05)。

2.2 大鼠肝组织Hepc、TMPRSS6、m-HJV蛋白及肌肉组织s-HJV 蛋白表达量比较 低氧7 d、15 d、30 d组肝组织Hepc蛋白表达量分别为6.341±0.609、5.713±0.469、5.387±0.699，肝组织TMPRSS6分别为1.25±0.18、2.63±0.23、3.95±0.50，肝组织m-HJV分别为0.81±0.08、0.32±0.04、0.17±0.02，肌肉组织s-HJV分别为1.50±0.16、2.90±0.26、5.10±0.40；常氧7 d、15 d、30 d组分别为7.363±1.352、7.145±1.342、6.627±1.323，1.03±0.10、1.06±0.11、0.97±0.09，1.06±0.14、0.98±0.10、1.10±0.13，1.05±0.08、1.10±0.10、0.97±0.09。低氧15 d、30 d组肝组织Hepc蛋白表达量低于常氧同时间组(P均<0.05)； 各低氧组肌肉组织s-HJV、肝组织TMPRSS6蛋白表达量高于常氧同时间组(P均<0.01)，肝组织m-HJV蛋白表达量低于常氧同时间组(P均<0.01)；随缺氧时间延长s-HJV、TMPRSS6表达量逐渐升高，m-HJV表达量逐渐降低(P均<0.01)。

2.3 大鼠肝组织Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉s-HJV mRNA表达量的比较 低氧7 d、15 d、30 d组肝组织Hepc mRNA表达量分别为1.42±0.61、0.85±0.25、0.54±0.38，肝组织TMPRSS6 mRNA分别为1.61±0.39、1.79±0.31、2.48±0.59，肝组织m-HJV mRNA分别为1.55±0.32、1.14±0.40、0.79±0.20，肌肉组织s-HJV mRNA分别为1.65±0.49、2.03±0.62、2.19±0.54；常氧7 d、15 d、30 d组分别为1.81±0.46、1.75±0.56、1.50±0.42，1.05±0.15、1.07±0.16、1.18±0.29，1.94±0.66、1.75±0.34、1.8±0.29，1.00±0.33、1.13±0.14、1.20±0.31。低氧各时间组肌肉组织s-HJV、肝组织TMPRSS6 mRNA表达量比常氧同时间组升高(P均<0.01)，随缺氧时间延长s-HJV、TMPRSS6 mRNA表达量逐渐升高(P均<0.01)；低氧15 d、30 d组肝组织Hepc、m-HJV mRNA表达量比常氧同时间组降低(P均<0.01)，随缺氧时间延长Hepc、m-HJV mRNA表达量逐渐降低(P均<0.01)。

3 讨论

CMS是高原地区一种常见病，其主要特征是红细胞过度生成和血液黏稠度提高[5]，常合并心脑血管疾病、缺血缺氧性肾病、肺栓塞等多种致死率较高的疾病，严重威胁高原人群的身体健康。已有研究证明，大鼠在低压低氧状态下呈现出Hepc水平的降低，这种低氧刺激部分是由于红细胞生成的增多导致铁利用增加，而红细胞生成增多是由低氧刺激促红细胞生成素所致。Hepc控制系统性铁稳态可应对不同的刺激，如机体总铁含量的变化、红细胞生成的增多、缺氧和炎症反应[6]。平原地区人进入高海拔地区，血清Hepc表达将受抑制，反映出红细胞生成铁需求增加，但在此情况下，Hepc受抑制的机制和原始刺激并不清楚。Talbot等[7]发现红细胞生成活动的激活，而不是缺氧本身，是高原地区抑制Hepc表达的主要刺激。

研究显示，HJV通过骨形成蛋白(BMP)/Smad信号通路调控Hepc基因转录发挥重要作用，体内实验分析得出，s-HJV抑制Hepc表达[8,9]。以25 mg/kg体质量的剂量在小鼠腹腔内注射重组s-HJV,每周3次，连续3周，导致Hepc表达受抑制，FPN的表达增加和动员来自网状内皮系统细胞的储存铁。外源s-HJV活动可使SI水平增加[8]。Babitt等[9]的试验证明了s-HJV和m-HJV共同调节Hepc的表达，以应对细胞外铁浓度的改变。HJV是目前惟一被识别的铁调节蛋白。低氧诱导TMPRSS6表达，TMPRSS6可裂解细胞膜表面的m-HJV，因此m-HJV表达下降。HJV除了被TMPRSS6裂解外，还被与反式高尔基区有关的弗林蛋白酶裂解。在低氧状况下，弗林蛋白酶上调，由过缺氧诱导因子通路介导的弗林蛋白的转录调控导致s-HJV水平升高。在体外，TMPRSS6通过裂解m-HJV,使其作为BMP信号通路共受体的功能受抑制。因此，TMPRSS6可能直接参与BMP信号通路，其酶活性对缺铁的反应和Hepc合成的下调是必需的。

本研究结果显示，低氧组TMPRSS6、s-HJV蛋白和mRNA表达量较常氧组明显升高，且随缺氧时间延长其表达量逐渐升高；低氧组m-HJV蛋白和mRNA水平较常氧组明显下降，且随缺氧时间延长其表达量逐渐下降；低氧组Hepc蛋白和mRNA表达量较常氧组明显下降，且随缺氧时间延长其表达量逐渐下降。提示高原低氧刺激TMPRSS6表达量增高，TMPRSS6进而结合和裂解m-HJV成为s-HJV，进一步抑制Hepc的表达,最终导致SI升高，这可能是Hepc在CMS中的重要调节机制。

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青海省科技厅应用基础研究计划基金资助项目(2014-ZJ-720)。

耿惠(E-mail：gh0227@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.011

R74.4

A

1002-266X(2017)13-0039-03

2016-12-02)