谢晓芳 彭 成

(成都中医药大学药学院,中药材标准化教育部重点实验室,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,成都,611137)

附子心脏毒效的多维评价和整合分析研究进展

谢晓芳 彭 成

(成都中医药大学药学院,中药材标准化教育部重点实验室,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,成都,611137)

附子是著名的川产道地药材,也是传统确有疗效有毒中药,心脏是其重要毒效靶器官,但毒-效相关性不甚明确。本文在彭成教授提出的“中药‘毒与效’的多维评价与整合分析”的研究思路指导下,紧密围绕中药“品质制性效用”六大元素,以本团队多年的研究成果为基础,并广泛整理国内外相关研究成果,按附子的心脏“毒-效”物质基础-附子的心脏“毒-效”机制-附子对心脏的增效减毒原理3个层面综述研究现状,整合分析附子对心脏的毒效机制。结果显示,附子中所含的双酯型生物碱是附子致心脏毒性的主要物质基础,而附子的强心和保护心肌作用是附子总碱、附子水溶性生物碱、附子多糖及其他一些成分等多成分综合作用的结果;附子对心脏的毒机制和效机制在心肌细胞上存在相同靶点,主要包括细胞形态和功能、细胞膜稳定性、细胞内环境稳态、离子转运相关ATP酶和通道、细胞能量代谢;但又有各自的独有机制;可通过依法炮制、合理配伍、辨证用药、延长煎煮时间和控制剂量等多种手段控制附子的心脏毒性和发挥其强心、保护心肌作用。

附子;心脏;毒-效;整合分析

附子为毛茛科(Ranunculaceae)植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品,是著名的、疗效确切的传统有毒中药,功效回阳救逆,温阳通脉,散寒止痛,传统广泛用于治疗心阳不足,胸痹心痛,如薏苡附子散;现代药理研究表明附子具有明显的强心和心肌保护作用,在现代临床附子也是治疗心力衰竭的常用药物。可见,心脏是附子的重要药效靶器官。而另一方面,传统古籍多处记载附子毒性大,但其毒性表现不甚清楚;现代毒理研究发现附子可引起实验动物心律失常,导致心肌纤维化和心肌细胞损伤,近现代临床的附子致不良反应事件中心律失常是其特征性的常见毒性表现。可见,心脏亦是附子的毒性靶器官。揭示附子心脏毒效机制对临床安全、合理使用附子具有重要意义。本文将在彭成教授针对有毒中药特点提出的“中药‘毒与效’的多维评价与整合分析”的研究思路指导下,紧密围绕中药“品质制性效用”六大元素,从附子的心脏“毒-效”物质基础-附子的心脏“毒-效”机制-附子对心脏的增效减毒原理3个层面综述研究现状,整合分析揭示附子对心脏的毒性和治疗作用特点。

1 附子的心脏“毒-效”物质基础

现代化学研究表明,附子主要含有生物碱和多糖,此外还有黄酮、甾醇、微量元素等。近年来本研究团队首次从附子中分离得到吡嗪类和吡咯类成分[1-2]。现代药理毒理研究显示,附子不同提取物对心脏的毒或效作用不同,其中又以生物碱类研究最多。

1.1 附子所含双酯型生物碱可导致心脏毒性,而水溶性生物碱具有强心作用 附子中的双酯型生物碱为脂溶性生物碱,易溶于乙醇等有机溶剂,而难溶于水。为了解不同提取物的心脏毒性,本研究团队从附子不同炮制品(泥附子、黑顺片、白附片)中均分别制备附子醇提物、附子水提物,进行灌胃小鼠、大鼠的急性毒性试验,结果显示,3个醇提物对小鼠均有明显的急性毒性,其LD50分别为5.054(4.798～5.361)g/kg、5.783(5.313～6.338)g/kg、6.872(6.173～7.724)g/kg,均可引起小鼠明显心脏毒性;表现为先出现心率加快和心律不齐,体热,皮肤、尾、足垫发红,心前区搏动明显加快,逐渐转为体凉,唇爪、尾部、耳、足垫苍白,唇爪发绀,最后心前区搏动减弱,心率减慢,死亡。3种醇提物分别以4.56、5.08、6.06 g/kg灌胃大鼠,也可引起类似的急性心脏毒性反应,解剖可见急性死亡的大鼠心肌充血,心脏系数增加,部分大鼠CK明显升高。泥附子醇提物6.20 g生药/kg灌胃大鼠3个月,早期给药时可观察到大鼠心前区搏动有所加快,心律紊乱,3个月末病理组织学检查发现部分大鼠心脏损伤,主要表现心肌小片状或灶性坏死、溶解,伴随慢性炎细胞浸润及纤维结缔组织增生,不可逆。这是附子长期给药的蓄积心脏毒性。而上述3个炮制品的水提物灌胃小鼠、大鼠无明显心脏毒性[3]。

进一步,团队制备附子总生物碱、附子脂溶性生物碱和附子水溶性生物碱开展相关研究。结果附子总生物碱按相当于生药量2.5 g/kg经十二指肠给药盐酸普罗帕酮致急性心力衰竭大鼠,可明显改善其心脏血流动力学,使心率增加,并可明显增加大鼠左心室内压最大上升速率(LV+dp/dtmax)和降低最大下降速率(LV-dp/dtmax)具有强心作用[4];附子脂溶性生物碱0.425 mg/kg股静脉注射大鼠,记录心电图发现可导致大鼠出现明明为的心律失常,并能持续19～42 min,而再次给予水溶性生物碱248.00、277.264、309.98 mg/kg,可明显缩短大鼠心律失常持续时间,且具有一定量-效正相关;1%附子脂溶性生物碱体外作用于原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,可导致其细胞活力明显下降、细胞死亡数增加、细胞超微结构破坏和细胞内Na+-K+-ATP酶活性降低,而当将之与水溶性生物碱按1∶1配伍给药时,上述心肌细胞损伤均明显降低。附子多糖与1%附子脂溶性生物碱按1∶1配伍则无明显作用[5]。此外,附子水溶性生物碱按1.25、2.50、5.00 mg/kg静脉注射,对盐酸普罗帕酮致急性心力衰竭大鼠可明显升高其心率和LV+dp/dtmax,降低LV-dp/dtmax,且能降低其血清Ang II、TNF-α、ANP、BNP、ALD水平;附子水溶性生物碱0.01、0.02、0.04 g/L体外作用于0.8%戊巴比妥钠诱导的原代培养大鼠心肌细胞心力衰竭模型,可明显提高细胞活力,增加细胞内Na+、Mg2+含量,提高细胞内Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,降低K+、Ca2+含量和Na+-K+-ATP酶活性[6-7]。上述结果表明,附子总生物碱具有强心作用,附子脂溶性生物碱具有显著心脏毒性和心肌细胞毒性,而附子水溶性生物碱具有强心作用的对抗附子脂溶性生物碱心脏毒性的作用,因而附子生物碱类是其引起心脏毒-效的重要物质基础。

乌头碱、新乌头碱和次乌头碱属双酯型生物碱,为脂溶性生物碱,是目前研究最多的乌头类生物碱,其中又以乌头碱的关注度最高。乌头碱对心脏和心肌细胞的毒性是得到公认的。如在心血管药理研究中,利用其毒性作为诱导动物快速心律失常的常用工具药[8]。Kentaro Wada等研究发现,当以1 mg/kg长期灌胃小鼠(22 d)时,可导致小鼠出现各种类型心律失常,但随着给药次数的增加或给药后时间延长,心律失常的频率显著下降[9]。Jean Pierre Pennect等发现乌头碱在1×10-6M时可导致欧洲鳗鲡离体灌流心脏心率减慢,而大于此浓度时则诱导快速性心律失常,直至心室肌细胞去极化[10]。在细胞层面,我们研究发现,乌头碱对原代培养大鼠乳鼠心肌细胞具有明显的毒性,可导致细胞损伤和死亡,且呈“量-时-毒”正相关,作用1 min的最大毒性浓度为3%,随着作用时间(0.5～30 min)延长毒性增强;而在相同作用时间(30 min)下存在最大毒性浓度(2%)和最低毒性浓度(0.2%)[3,11]。

新乌头碱和次乌头碱也具有显著心脏毒性。李志勇等研究表明,次乌头碱30、60、120 μM对体外培养乳大鼠心肌细胞具有明显毒性[12];王相冲等研究显示,新乌头碱以25 μg/kg股静脉注射豚鼠可致其发生多种类型的心律失常,以1×10-7M、3×10-7M体外处理豚鼠心室肌细胞可影响其动作电位[13]。

而另一方面乌头碱、新乌头碱和次乌头碱在低浓度时具有心肌细胞保护作用。如我们的研究发现,当乌头碱浓度较低(1×10-9M)时,对0.8%戊巴比妥钠诱导的大鼠乳鼠原代培养心肌细胞损伤有保护作用;张硕峰等以50 μg/mL的乌头碱预防性股静脉推注给大鼠,可减轻尼莫地平所致大鼠心力衰竭,表现为心率、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax和RPP异常均得到改善[14],新乌头碱和次乌头碱也对该模型所致快速心率和心功能异常有改善作用[15]。方堃等研究显示,用250 ng/mL的次乌头碱预处理大鼠乳鼠原代培养心肌细胞,可减少H2O2诱导的细胞细胞增殖活力下降和细胞凋亡的发生,降低细胞内Caspase 3和Caspase 9的表达[16]。

去甲乌药碱是较早被认识到具有强心作用的附子生物碱,静脉滴注2 μg/kg可使豚鼠正常心脏收缩力加强,也可加强离体豚鼠衰竭心脏的收缩功能,但普奈洛尔可使之对离体豚鼠心脏右心房加速自律性的量效曲线右移,提示可能是β受体部分激动剂[17-18]。近年来还有一些成分被报道有强心作用。如王璐等采用离体蛙心脏观察了从附子中分离得到的13个胺醇型二萜生物碱的强心活性,结果发现北乌头碱、新乌头碱、乌头原碱、3-去氧乌头原碱、异塔拉定具有强心活性[19]。另外,日本有报道日本附子中所含的去甲乌药碱是附子强心作用的重要物质基础,但该成分至今尚未在我国江油附子中分离到。

1.2 附子多糖是保护心肌细胞的有效物质之一 附子多糖是附子的主要成分之一,也是附子的重要药效物质基础。过去附子多糖的药理研究主要集中在调节免疫方面,而近年来发现,附子多糖可能也是附子强心、保护心肌的药效物质之一。刘古锋等将附子多糖预防性灌胃游泳力竭小鼠14 d,结果可显著提高小鼠运动耐力,升高小鼠心肌SOD、CAT、GSH-Px活性,同时降低MDA含量,并降低心肌细胞凋亡指数,升高Bcl-2表达而抑制Caspase 3的表达[20]。刘颖等采用大鼠乳鼠原代培养心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,给予10 mg/mL的附子多糖干预,结果可明显增加细胞存活率,减少LDH、CK的释放和降低细胞内Ca2+浓度,亦能抑制细胞凋亡的发生[21]。上述结果表明,附子多糖是附子保护心肌的药效物质基础之一。

1.3 其他具有强心或保护心肌作用的成分 除了生物碱类和多糖,还有一些成分被报道对心肌细胞具有活性。韩公羽等对从附子中分离得到的尿嘧啶、附子苷作用于蟾蜍离体心脏,结果均可明显加强其收缩作用[22-23]。本研究团队从附子中分离得到的新成分吡嗪类和吡咯类成分均对戊巴比妥钠诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞损伤有一定保护作用[1-2]。

2 附子的心脏“毒-效”机制

附子对心脏的毒性主要有急性毒性、慢性毒性和细胞毒性,引起毒性的机制包括破坏心肌细胞形态、结构和功能,以及影响心肌传导系统,其中绝大部分毒性机制研究均是以心肌细胞为靶点。

2.1 附子致心脏毒性机制

2.1.1 引起急性心脏毒性 急性心脏毒性是指24 h内1次或多次给予附子后,可引起心脏功能、形态、生化等的异常。本团队开展的附子不同炮制品醇提物灌胃小鼠、大鼠的急性心脏毒性试验显示,附子醇提物可引起急性心律失常,剂量较小时症状可逐渐缓解,而当剂量较大时症状逐渐加重,最终因呼吸-循环衰竭而急性死亡,解剖可见心脏充血明显,心脏的脏器指数增加。对急性中毒大鼠进行血液生化检查发现部分大鼠血清CK水平明显升高,病检部分大鼠心肌充血[3]。冯群等以心电图、血生化指标(CK、LDH、BNP、cTn I)和脏器指数(心、肝、肾)为评价指标观察给予小鼠单次灌胃7.20 g/kg后0～120 min的“时-毒”相关性,及分别灌胃7.20、4.64、2.99、1.93、1.25 g/kg后的“量-毒”相关性,结果显示,附子可引起小鼠心率和ECG(QRS间期、R波幅度、T波时间和幅度、QT间期)异常,血清CK、LDH、BNP、cTn I水平逐渐升高,且呈明显“时-毒”正相关和“量-毒”正相关;但对小鼠重要脏器指数均无明显影响[24]。附子不同炮制品(生附子、黑顺片、白附片)水煎液均以0.27、1.35、5.4 g/kg对麻醉大鼠经十二指肠给药,亦可导致ECG明显异常和血清CK、LDH升高,并呈一定量-毒正相关[25]。

2.1.2 引起慢性心脏毒性 我们在前期开展的附子醇提物长期毒性试验,结果6.20 g生药/kg灌胃大鼠3个月,不引起明显毒性反应,但早期给药时在给药后心前区搏动有所加快,心律紊乱,雄性大鼠耗食量降低,随后恢复正常;病理组织学检查发现部分大鼠心脏损伤,主要表现心肌小片状或灶性坏死、溶解,伴随慢性炎细胞浸润及纤维结缔组织增生[3]。

2.1.3 导致心脏功能异常 杨龙坡等采用大鼠离体心脏灌流技术发现,附子总碱可导致离体心脏血流动力学下降,使心率加快,使左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)、±dp/dtmax明显降低,且与累积给药量呈正相关趋势,同时使左心室舒张末期压(LVEDP)上升[26]。

2.1.4 细胞毒机制 大量的实验研究以乌头碱作为附子的主要毒性成分,观察其对心肌细胞的毒性;也有一些研究以新乌头碱、次乌头碱开展毒性机制研究。结果发现附子的心肌细胞毒性包括心肌细胞形态和超微结构损害、损伤细胞膜稳定性、细胞能量代谢异常、酶和受体损伤、细胞增殖抑制等。1)抑制心肌细胞搏动和破坏细胞形态、结构。大鼠乳鼠原代培养心肌细胞具有节律性搏动,甚至连成片,乌头碱可导致该搏动异常,毒性较大时完全抑制。我们的研究显示,1 μM的乌头碱作用5 min即可导致大鼠乳鼠原代培养心肌细胞自发搏动的频率加速,甚至抽搐样,随着时间延长又逐渐变慢至恢复正常,当浓度到2 μM时亦先快后慢,并最终搏动被部分或完全抑制,因此认为可以将之作为心律失常细胞模型[27];暴露于3%乌头碱中30 s即出现形态损伤,可见细胞间连续减少、空隙增加,细胞收缩和胞体变小,细胞内见颗粒状物,伊红染色进一步发现细胞核周围有空隙存在,细胞伪足缩短或变少,随着给药时间延长上述损伤加重,至30 min细胞极度萎缩,细胞质内大量空泡和颗粒,细胞核碎裂;电镜下可见作用30 s时,细胞核呈不规则型,染色质浓缩,核内出现大量的空泡,核仁、核膜清晰,胞质内线粒体肿胀,嵴模糊、断裂、减少或消失,基质密度变浅,部分线粒体溶解,溶酶体肿胀,胞质中出现大量的空泡,伴局灶性肌丝溶解,部分细胞器失去结构,细胞膜不完整;随着暴露时间延长核仁消失,胞质内线粒体膜结构肿胀或破裂消失,大量的溶酶体出现,细胞膜不完整;至30 min细胞核染色质几乎全部丢失,核膜呈锯齿状,肌丝全部溶解,胞质细胞器消失,甚至细胞破裂。在上述损伤前,原代培养心肌细胞搏动明显减弱,甚至消失[3,28]。次乌头碱60、120 μM也可引起原代培养大鼠乳鼠心肌细胞搏动减弱和形态异常[29]。2)损伤细胞膜稳定性。我们的研究显示,3%乌头碱作用30 s、1 min、30 min或0.63%、1.13%、2%乌头碱作用30 min,均可导致原代培养大鼠心肌细胞漏出LDH、ACP增加[3,28]。3)干扰细胞能量代谢,破坏线粒体。我们的研究显示,3%乌头碱作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%乌头碱作用30 min,均可导致原代培养大鼠心肌细胞内糖原含量降低,3%乌头碱作用1、30 min使细胞内SDH活力下降,cAMP/cGMP比值显著升高[3,28];3%新乌头碱和次乌头碱分别对心肌细胞作用30 s、1 min、30 min,均能显著升高心肌细胞内IP3的生成,同时显著升高cAMP/cGMP的比值[30];0.2%乌头碱可使细胞色素C氧化酶活性亦降低[31]。赵佳伟等将来源于大鼠的H9C2心肌细胞系暴露于附子水提取物12.5、25、50、100 g/L中24 h,结果可导致细胞线粒体膜电位下降,线粒体内活性氧(ROS)和超氧化物荧光表达增强,而Ca荧光强度降低,同时导致细胞内线粒体生物合成关键因子Pgc-1降低,使凋亡相关蛋白Bcl-2下调和Bax上调,从而多途径导致心肌细胞线粒体损伤[32]。4)破坏细胞内稳态,影响离子交换相关酶和通道开放,造成细胞内钙超载。我们的研究显示,3%乌头碱作用30 s、1 min、30 min或0.2%作用1 h,均可导致原代培养大鼠心肌细胞离子水平异常,Na+、Ca2+含量显著增加而K+、Mg2+含量显著降低,使心肌细胞Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降,其中以Ca2+-ATP酶活性下降最显著[28,33]。乌头碱引起的心肌细胞内钙超载和离子水平紊乱被认为是其导致心律失常、心肌损伤的重要原因,而引起上述变化与乌头碱抑制了心肌细胞膜上调节离子转运相关ATP酶活性、电压或门控式离子通道开放有关。早在20世纪国外采用膜片钳技术研究就发现,乌头碱可使大鼠乳鼠心肌细胞上L型钙通道开放数量和开放时间均降低[34];近年研究显示,乌头碱可增加大鼠心肌细胞胞质内L型钙通道电流,增加NCX表达而降低SERCA2a表达,从而触发心律失常发生[35]。乌头碱可使成年小鼠心室肌细胞上的电压钠离子通道开放数量增加和再次开放,钠通道阻滞剂河豚毒素可降低乌头碱致小鼠心电图异常,均表明乌头碱可兴奋钠通道[36-37]。近年来又发现,乌头碱可抑制H9c2心肌细胞系上超速延迟钾电流(IKur),且呈明显依赖性,对它的影响也符合其作用于大鼠乳鼠原代培养心室肌细胞时细胞心电图的改变[38]。进一步研究发现,乌头碱对钾、钠、钙离子通道调控的影响可能是通过调节通道相关蛋白Nav1.5、Kv4.2、RyR2、NCX的表达达到[33,39]。次乌头碱致心肌细胞心律失常的钙超载机制与乌头碱相似,并降低心肌细胞缝隙连续Cx43蛋白表达而使细胞更易于发生心律失常[29]。5)抑制细胞增殖。我们的研究显示,3%乌头碱作用30 s、1 min、30 min,可明显降低原代培养大鼠心肌细胞增殖活力,且随着作用时间延长,使细胞周期的S期缩短而G0期延长,因而G0/G1明显升高,G2+M则先延长后缩短[28]。6)其他。我们的研究显示,3%乌头碱作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%乌头碱作用30 min,均可导致原代培养大鼠心肌细胞内MDA含量明显增加[3,28];次乌头碱0.23、0.69、2.07 mg/kg灌胃大鼠,连续7 d,可明显抑制其心肌组织中钙调蛋白(CaM)的蛋白和mRNA表达,同时显著抑制细胞缝隙连接蛋白CX43(Ser368)磷酸化[29]。

2.2 附子强心作用机制 临床上,附子常用于治疗急性心力衰竭和慢性心力衰竭。现代药理研究亦显示,附子对急性心力衰竭和慢性心力衰竭均有治疗作用,可改善其心脏血流动力学和抑制心室重松,机制涉及改善心力衰竭发生发展密切相关的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、炎性反应因子等神经内分泌和体液因子分泌,升压,保护心肌细胞等。1)调节神经内分泌和体液因子分泌。为探讨附子回阳救逆、强心的作用,我们团队早在2008年采用盐酸普罗帕酮建立了心阳虚急性心力衰竭大鼠模型[40]和阿霉素合氢化可的松诱导的心肾阳虚慢性心力衰竭模型[41],已被广泛认可和应用。采用上述模型我们研究发现,白附片水煎液1.5 g/kg十二指肠给药,可增强盐酸普罗帕酮致心阳虚急性心力衰竭大鼠的心率,增加LV±dp/dtmax绝对值,水煎液还有升高血浆肾素、心钠肽(ANP)和内皮素(ET)的趋势[42-43];进一步研究显示,附子总碱2.0 g/kg,附子水溶性生物碱1.25、2.50、5.00 mg/kg,或乌头碱5 μg/kg经十二指肠给药,对上述急性心力衰竭大鼠也能明显增强血流动力学,水溶性生物碱明显降低ALD、ANP和BNP水平,乌头碱可降低血清ALD水平[6,33-44]。吴美平等以结扎冠状动脉左前降支制备的心肌梗死心力衰竭大鼠模型,给予灌胃附子水煎液4.5、9.0 g/kg,连续4周,可明显改善其心脏血流动力学参数,降低左心室质量指数,并显著降低血清AngII水平[45]。张俊平等给予阿霉素诱导的慢性心力衰竭大鼠灌胃附子水煎液21 d,结果可明显降低大鼠血清NO、TNF-α含量[46]。附子水煎液按4.5、9.0 g/kg灌胃冠脉结扎致慢性心力衰竭大鼠连续21 d,可明显改善其血流动力学,但对升高的Ang II、ALD和左心室脏器指数无下降作用,高剂量组反而使之升高,提示附子对慢性心力衰竭的治疗不能调节紊乱的RAAS系统和抑制心室重构[47]。2)升压。附子提取物30 g/kg经十二指肠给药戊巴比妥钠诱导的急性心力衰竭大鼠,可显著升高其降低的心率、LVSP及LV±dp/dtmax,但当同时给予静脉注射酚妥拉明500 μg/kg时可减弱其对LVSP的升压作用,给予静脉注射普奈洛尔300 μg/kg可一定程度抑制其升高LVSP和加快心率的作用,表明附子对心力衰竭大鼠增强心室内压作用与激活肾上腺素能α、β受体均有关[48]。附子全组分、水组分和醇组分均对正常大鼠和放血致低血压大鼠有升压作用,主要以升高收缩压为主,用呈现明显的“量-时-效”关系[49]。3)保护心肌细胞。附子对心肌细胞有保护作用,可以增强其增殖活力、保护细胞膜稳定性、改善细胞内环境、调节离子转运相关ATP酶和离子通道、抗细胞凋亡等。我们前期采用0.8%戊巴比妥钠处理体外培养大鼠乳鼠心肌细胞制备心肌细胞心力衰竭模型,表现为心肌细胞搏动明显抑制,细胞内离子水平紊乱和细胞膜上离子转运相关ATP酶异常。对这样的细胞,我们用附子水溶性生物碱0.1、0.2、0.4 g/L作用1 h,结果可使细胞搏动恢复,使细胞内异常升高的Ca2+、K+水平降低和异常降低的Na+、Mg2+水平升高,同时使Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力增加和Na+-K+-ATP酶活力降低[7];乌头碱1×10-7M对该模型细胞也有相似保护作用,可明显降低细胞内K+水平和Na+-K+-ATP酶活力,增加Ca2+-ATP酶活力[33];此外,乌头碱1×10-7M、1×10-9M还能使该心力衰竭细胞漏出LDH、ACP减少[33,50]。郭雄等采用膜片钳技术观察附子含药血清对大鼠心室肌细胞L-钙通道(Ica-L)的影响,结果显示,附子含药血清可以增加Ica-L的电流密度、激活曲线左移,失活曲线右移[51],这可能是附子治疗缓慢型心律失常的机制之一。范颖等给予阿霉素致的心脏毒性损伤大鼠灌胃附子水煎液1.75 g/kg,连续30 d,结果可使心肌线粒体中Bcl-2表达升高而Bax表达下降,因而Bcl-2/Bax比值显著升高,并使caspase-3、caspase-9表达均下降,从而抑制阿霉素所致心肌细胞凋亡。

3 以心脏为靶点的附子增效减毒原理

3.1 依法炮制 炮制是附子减毒的重要手段。炮制过程中,附子所含的双酯型生物碱水解为毒性较小的单酯型生物碱苯甲酰乌头胺、苯甲酰中乌头胺和苯甲酰次乌头胺,进一步水解成毒性更小的胺醇类乌头胺、中乌头胺和次乌头胺,从而使毒性降低70%～80%。而炮制所用胆巴中含有镁盐,有助于双酯型生物碱的溶出、水解和拮抗乌头碱心脏毒性的作用[52]。如我们的研究显示,泥附子、黑顺片和白附片的醇提物灌胃小鼠的LD50以泥附子最小,急性心脏毒性的表现最剧烈,而炮制品黑顺片和白附片的LD50相对较大,毒性也相对缓和[3]。亦贾雪岩等比较了生附子和不同炮制方法的4个炮制品(黑顺片、高温片、高压片、微波片)及煎煮液中双酯型生物碱的含量,并采用langendorff大鼠离体心脏灌流法比较其对心功能影响。结果显示,经炮制后的4个炮制品的双酯型生物碱含量均较生附子含量明显降低,而单酯型生物碱逐渐增加,其相应煎煮液中6种生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次原乌头碱)的溶出率与炮制品中生物碱水平呈正相关,而4个炮制品均可增加离体心脏的HR、LVSP、±dp/dtmax和降低LVEDP,以高压片中生物碱保存量最高、药效最明显[53]。可见,炮制过程中可通过使双酯型生物碱水解为单酯型生物碱而达到降低心脏毒性和增强强心作用。

3.2 合理配伍 附子在心脏方面的配伍“增效减毒”存在两方面,一是附子自身存在组分配伍调控其心脏的毒效作用。我们的前期研究发现,附子中存在导致心律失常的毒性组分脂溶性生物碱,同时存在对抗该毒性的控毒组分水溶性生物碱,可有效对抗脂溶性生物碱所致大鼠心律失常和原代培养心肌细胞毒性[5];二是附子与其他中药配伍治疗心律失常、心力衰竭等心脏疾病,如常与甘草、干姜、人参等配伍。我们按照“饮片配伍-组分配伍、成分配伍”的3个层次,从化学和药理毒理学两方面,系统研究了附子配伍干姜治疗急、慢性心力衰竭的增效减毒原理,附子配伍人参治疗心力衰竭的增效减毒原理,及附子配伍甘草治疗心律失常的增效减毒原理[54]。结果显示,在上述配伍中,干姜、人参、甘草均可促进附子中总生物碱和酯型生物碱的溶出而降低双酯型生物碱的含量,从而在化学层面尽量保存了有效物质而降低了毒性物质含量;在药效方面：1)附子干姜配伍,干姜提取物、干姜挥发油与附子总碱配伍均可降低附子总碱灌胃正常小鼠的急性毒性,同时附子总碱与干姜提取物、干姜挥发油配伍,对急、慢性心力衰竭大鼠血浆TNF-α、AngⅠ、AngⅡ、ANP、ET、TNF的水平有一定的调控作用;也能抑制慢性心力衰竭模型大鼠心肌重构效应,体现增效减毒。2)附子人参配伍,即参附注射液的组成。我们团队围绕参附注射液开展了其治疗心力衰竭增效减毒原理研究,采用整体(盐酸普罗帕酮致急性心力衰竭模型)和离体(原代培养正常心肌细胞和心肌细胞心力衰竭模型)模型,从组分配伍(红参提取物、附子提取物)和成分配伍(附子与人参皂苷Rg1、Rb1配伍)2个层面,开展了系列药理研究,结果显示,一方面红参中的皂苷类成分可对抗附子中毒性成分乌头碱所致的心肌细胞活力下降、细胞膜紊乱、细胞因子分泌异常等心肌细胞毒性;另一方面附子中成分在一定状态下(如乌头碱在低浓度1×10-7M、1×10-9M)又可与皂苷类成分协同增效,共同改善心力衰竭细胞的细胞因子分泌和细胞结构、功能,从而表现出减毒增效机制。3)附子甘草配伍,从化学角度分析,甘草皂苷和甘草黄酮等具有酸性基团,可与附子生物碱的碱性基团结合形成盐,从而改变了附子中生物碱的存在形式,降低了毒性;在药理研究中发现,甘草皂苷、甘草黄酮可有效降低附子脂溶性生物碱诱导的大鼠心律失常持续时间,并减轻其对原代培养大鼠乳鼠心肌细胞的损伤。甘草多糖对附子脂溶性生物碱的毒性无控毒作用。上述研究科学阐释了合理配伍可调控附子对心脏的毒、效。

配伍不当,使附子心脏毒性增强。按照中药“十八反”规定,附子不宜与贝母同用。如刘萍等观察了灌胃白顺片水煎液或白顺片+贝母2.5 g/kg,连续14 d,结果均可导致大鼠心脏指数升高和心肌组织形态学损伤,但白顺片+贝母组损伤较白顺片组明显;瓜蒌亦可增强附子的心脏毒性[55]。而按中药相畏、相杀原则将附子与黄芪、防风或远志配伍时,其心脏毒性可得到部分减轻[56]。上述研究体现了中药“十八反”“七情”配伍原则的科学性,附子临床用药时应遵守配伍原则。

3.3 辨证用药 Min Li等研究发现,在大鼠清醒状态下,里昂高血压大鼠较里昂低血压大鼠更易被乌头碱诱导心律失常[57]。赵庆华等研究发现,附子水提组分1.08、1.35 g/kg灌胃可导致正常大鼠血清LDH水平升高,而1.08 g/kg组无异常,但当给予放血法致低血压大鼠时,1.08 g/kg组亦出现LDH显著升高,表明其对心肌损伤毒性与机制状态有关[49]。

3.4 延长煎煮时间 在附子的传统应用中,要求“先煎,口尝无麻味”,其实质即是通过延长煎煮时间,使双酯型生物碱充分水解,从而降低附子毒性,也降低了其心脏毒性。我们采用盐酸普罗帕酮建立大鼠心阳虚急性心力衰竭模型,按均匀设计法设计实验方案,观察白附片不同煎煮时间水煎液(15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)不同剂量的强心作用,结果显示,上述提取物均能明显提高心阳虚大鼠心率,显著升高+LV dp/dtmax,降低-LV dp/dtmax,经回归分析提示,以煎煮6 h、剂量为12 g/kg时作用最好[58]。

3.5 控制剂量 剂量是中毒的重要因素。附子中双酯型生物碱既是其致心脏毒性的毒性物质基础,亦是强心药效物质,关键在于剂量。我们的研究显示,附子中的乌头碱当浓度为3%时,作用5 s即可引起体外培养心肌细胞活力明显下降,30 min可致细胞破裂、死亡,而浓度降至0.2%(3×10-3M)时毒性明显减轻,需作用30 min才使细胞活力明显下降,进一步降至1×10-7M时,对正常心肌细胞无毒性,且对0.8%戊巴比妥钠致心肌细胞心力衰竭模型有保护作用[3,28,33]。次乌头碱、新乌头碱在不同剂量下也分别表现为心脏毒性和心脏保护作用。赵庆华等研究发现,附子全组分0.2、0.54、0.81、1.08、1.35 g/kg灌胃可升高正常大鼠和低血压大鼠血压,但1.35、0.81 g/kg组为先降压后升压,而其余3个组在给药60 min内一直呈升压作用,且1.35、1.08 g/kg组导致血清中LDH升高,1.35、1.08、0.81、0.54 g/kg组CK明显升高,提示对心肌有损伤[49]。可见,随着剂量的增加,虽然升压作用仍存在,但毒性也出现了。

4 总结

附子是传统确有疗效的有毒中药,是临床上用于治疗心力衰竭的常用中药。本文经综述可见,附子中引起心脏毒性的主要毒性物质是双酯型生物碱,强心和保护心肌细胞有效物质主要有附子总生物碱、附子水溶性生物碱、附子酯型生物碱、附子多糖及腺苷、尿嘧啶等成分;附子致心脏毒性和强心作用存在共有靶点,主要包括心肌细胞形态和超微结构、心肌细胞膜稳定性、心肌细胞内离子稳态和离子转运相关ATP酶和离子通道,心肌细胞能量代谢;附子致心脏毒性的机制还有损伤心肌细胞线粒体、抑制细胞增殖;附子强心作用机制还有调节神经内分泌体液因子分泌、升压。临床应用中,一定要按照辨证论治的法则使用附子,使用过程中应注意选用合适的炮制品、合理配伍、严格按照处方剂量和煎煮方法用药,使附子药效得到最大应用而毒性得到有效控制。

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StudyProgressofMultidimensionalEvaluationandIntegratedAnalysisbetweenToxicityandEfficacyonHeartofRadixAconitiLateralisPraeparata

Xie Xiaofang, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

As a famous geo-authentic medicine distributed in Sichuan Province, Radix Aconiti Lateralis Praeparata is also a traditionally toxic medicine with curative effect in clinic. Heart is the key target for both toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata. However, the correlation between toxicity and efficacy on heart remains unknown. Under the guidance of the research idea “multidimensional evaluation and integrated analysis between ‘toxicity and efficacy’ for Chinese materia medica” proposed by professor Peng Cheng, the article tightly focused on the six factors as “variety, quality, processing, property, efficacy, application” of Chinese materia medica. The research status of ‘toxicity-efficacy’ material basis, mechanism, and effect-enhancing and toxicity-reducing principle for Radix Aconiti Lateralis Praeparata on heart were summarized based on our years of researches and other relative researches at home and abroad. Cardiac toxicity-efficacy mechanism was integrated analyzed then. It was shown that diester-type alkaloids (DA) was material base for heart toxicity in Radix Aconiti Lateralis Praeparata, while total alkaloids (AD), water-soluble alkaloids (WA), polysaccharide and some other compounds in Radix Aconiti Lateralis Praeparata were responsible for effects of cardiotonic and protecting myocardial cells. There were the same targets in myocardial cells for toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, such as cell morphology and function, membrane stability, cellular environmental homeostasis, ion transport-related ATPase and channels, and energy metabolism. However, there was some respective mechanism for each other. Multi-means could be taken to control cardiac toxicity and enhance effects on heart for Radix Aconiti Lateralis Praeparata, including legal processing, reasonable compatibility, differentiation for use, extending time of decoction, dosage control.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Heart; Toxicity-efficacy; Integrated analysis

国家自然科学基金重点项目(81630101);国家发改委标准化项目(ZYBZH-C-SC-51);国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金(J1310034);四川省中医药管理局“川产道地药材综合开发与区域发展”项目(2016ZY008)

谢晓芳(1983.02—),女,博士,副研究员,研究方向：中药药理与毒理研究,E-mail:xxf14544@163.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生导师,研究方向：中药毒效的系统评价与整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.003

(2017-10-09收稿 责任编辑：王明)