佳莉娟，曹秀琴，王 琦

免疫性不孕症患者血清抗体及可溶性FcγRIIB功能检测及相关机制的初步研究

佳莉娟1，曹秀琴2，王 琦3

目的 通过检测免疫性不孕症患者及正常人群血清免疫性抗体及可溶性FcγRIIB功能，探讨分析FcγRIIB在免疫性不孕症中的相关作用机制。方法 选取免疫性不孕症患者30例为观察组，同期体检健康女性30例为对照组。ELISA 法检测所有受试者血清中可溶型FcγRIIB含量、与免疫复合物结合力以及抗精子抗体(AsAb)、抗心磷脂抗体(AcAb)、抗子宫内膜抗体(EmAb)等免疫性抗体。结果 观察组血清中可溶性FcγRIIB浓度低于对照组(t=-9.528，P<0.0001)，差异有统计学意义。相同DNA孵育浓度下，观察组血清可溶性FcγRIIB与IC结合力高于对照组。观察组AsAb、AcAb等抗体阳性率高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义。结论 FcγRIIB表达水平下降可能与免疫性不孕的发生发展有一定关系。

不孕症；免疫性因素；FcγRIIB；发病机制

在我国已婚夫妇中，不孕症的发生率约为10%～15%，而其中因免疫性因素所导致的不孕约占30%～40%[1-2]。免疫性不孕症患者体内存在抗精子抗体、抗子宫内膜抗体以及抗透明带抗体等多种抗体，可对受精卵的形成或着床造成影响，进而引发不孕。FcγRIIB属免疫球蛋白超家族，是IgG Fc 受体(FcγR)中唯一的抑制型受体，主要介导负反馈效应，维持外周免疫耐受的平衡，调节机体固有免疫和适应性免疫[3]。本研究即对免疫性不孕症患者血清免疫性抗体及可溶性FcγRIIB功能进行检测，并对相关作用机制进行初步分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年2月至2015年12月于宁夏医科大学第一附属医院就诊的免疫性不孕症患者30例为观察组，年龄(33.2±6.6)岁，不孕时间(24.6±9.2)个月，临床检查显示原发性不孕16例，继发性不孕14例。同期体检健康女性30例为对照组，年龄(31.3±5.6)岁；有妊娠生育史19例，无妊娠生育史11例。

1.2 免疫性不孕纳入标准 ①正常夫妻生活12个月以上，未采取避孕手段而女方不孕。②造影检查示双侧输卵管通畅，B超示子宫正常；③B超连续监测示排卵正常，基础体温呈双向型；④免疫性不孕抗体至少1项为阳性。

1.3 排除标准 ①男方因素导致的不孕；②生殖器畸形或染色体异常；③内分泌激素检测异常。

1.4 检测方法

1.4.1 材料及设备 诱导纯化FcγRIIB蛋白为本实验室保存；山羊抗人FcγRIIB购于sigma公司；HRP标记兔抗人FcγRIIB(Rabbit Anit-CD32)、山羊抗人IgG(GoatAnit-human IgG/HRP)均购于北京博奥森生物技术有限公司；双组分TMB显色试剂盒购于美国Proteintech公司；所有试剂盒均购自南京建成生物技术研究所；全自动酶标仪酶标仪Model 680购自BIO-RAD公司。

1.4.2 血清可溶性FcγRIIB含量的检测 空腹取外周静脉血3 mL，3 000 r·min-1离心10 min，取血清。FcγRIIB抗体1∶2 000稀释，每孔100 μL加样ELISA板中，4 ℃孵育24 h，用洗涤液洗板，封闭液封板，4 ℃孵育24 h，待测血清(正常人、不孕症患者血清各30例)1∶100与稀释液稀释后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min，弃液，洗ELISA板， 抗FcγRIIB抗体1∶2 000稀释，每孔100 μL加样ELISA板中，37 ℃孵育30 min，弃液，洗板，HRP标记羊抗人抗体1∶1 000稀释后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min。洗板，加底物显色液100 μL，避光显色20 min后加终止液50 μL，全自动酶标仪测定吸光度(A)值。

1.4.3 可溶型FcγRIIB与免疫复合物(Immune complex, IC)的结合力检测 取血清，分别与0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg·mL-1浓度的小牛胸腺DNA37 ℃孵育30 min，另取1.25 μg·mL-1FcγRIIB 每孔100 μL包被ELISA 板，加入孵育后的上述不同浓度标本，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板。待测血清(正常人、不孕症患者血清各30例)1∶100与稀释液稀释后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min，弃液，洗ELISA板， HRP标记羊抗人抗体1∶1 000稀释后加至ELISA板中，37 ℃孵育30 min。弃液洗板，底物显色液每孔100 μL，37 ℃孵育20 min，每孔加100 UI终止液，全自动酶标液测定吸光值，以倍比稀释标准品制作标准曲线，计算出待测血清标本可溶性FcγRIIB免疫复合物结合力。

1.4.4 免疫性抗体检测 ①检测项目：抗精子抗体(anti spermatozoa antibody,AsAb)、抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody,AcAb)及抗子宫内膜抗体(antiendometrium antibody,EmAb)。②检测方法取血清，严格依据说明书，采用AsAb、AcAb和抗EmAb ELISA试剂盒行血清抗体检测，全自动酶标检测仪测定吸光度值并判定结果。

1.5 统计分析 采用SPSS19.0软件，独立样本t检验分析两组受试者血清中可溶性FcγRIIB含量及与IC结合力，χ2检验分析免疫性抗体阳性率，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清可溶性FcγRIIB含量 不孕症患者血清可溶性FcγRIIB的水平低于正常人，30例不孕症患者可溶性FcγRIIB含量102.54±21.44；30例正常人血清可溶性FcγRIIB含量148.15±24.38，不孕症患者与正常人血清中可溶性FcγRIIB浓度有显著有统计学意义(P<0.0001)。

2.2 可溶型FcγRIIB结合力 随小牛胸腺DNA浓度的增加，两组受试者所测定获得的A值呈增加趋势，当孵育DNA 浓度为0.8 mg·mL-1时，A值趋于稳定。对不同浓度DNA浓度下两组A值进行比较显示，观察组A值均大于对照组。见图1。

图1 两组受试者可溶型FcγRIIB与IC的结合力比较

2.3 免疫性抗体阳性率比较 观察组AsAb、AcAb和EmAb阳性率均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。在对不同免疫性不孕症类型进行分析显示，原发性不孕患者AsAb阳性率较高，而继发性不孕患者AcAb和EmAb阳性率较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1-2。

表1 免疫性不孕症与正常人免疫性抗体比较 例(%)

注：AsAb:抗精子抗体；AcAb:抗心磷脂抗体；EmAb:抗子宫内膜抗体。

表2 不同类型免疫性不孕患者抗体阳性率比较 例(%)

注：AsAb:抗精子抗体；AcAb:抗心磷脂抗体；EmAb:抗子宫内膜抗体。

3 讨论

免疫性不孕又称变态反应性不孕，由生殖系统抗原的自身免疫或同种免疫引起。在不孕症患者中，超过20%原因未明，其中大多数可以归结为免疫因素[4]。目前已知的致病抗体有抗透明带抗体、抗精子抗体、抗心磷脂抗体、抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体等。可对卵泡发育、精子的输送、受精卵的形成、受精卵着床及发育等一系列过程造成影响，进而导致不孕症的发生。

FcγRIIB是唯一的Fcγ抑制性受体，位于染色体1q23 上，在巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞以及嗜酸性粒细胞中广泛表达[5]，主要介导负反馈调节效应，负性调节机体适应性免疫以及固有免疫。FcγRIIB维持外周免疫耐受的平衡主要通过依赖ITIM 的方式进行，但也可通过不依赖ITIM 的方式传导抑制信号，进而对抗体的分泌、细胞的增殖等多种生物学效应进行调节[6-7]。FcγRIIB表达异常可引起相关免疫性疾病的发生，动物实验显示，FcγRIIB基因敲除小鼠均表现为原有自身免疫病加重或自身免疫病易感趋势[8]。

免疫性不孕症患者对抗精子抗体等不能进行免疫耐受，从而导致了不孕症的发生[9]。马佳佳等[10]研究发现，在体外环境下，IL-17R-FcγRIIB融合基因可阻断CD86/CD28共刺激通路，诱导树突状细胞免疫耐受状态，并可对Th1/Th1/Th17分化以及抗原特异性T细胞增殖进行抑制。FcγRIIB是抑制B 细胞激活的关键受体，徐利玲[11]研究显示，FcγRIIB可对B细胞的活化进行抑制，调节免疫耐受，进而可对系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病相关抗体的分泌进行抑制。因此，推测在免疫性不孕症患者机体内，其FcγRIIB表达水平可能存在异常。在对免疫性不孕症患者血清可溶性FcγRIIB进行检测显示，与正常人群相比较，免疫性不孕症患者血清中可溶性FcγRIIB浓度及自身抗体分泌能力均较低，提示较低水平的FcγRIIB不能对B细胞的活化进行抑制，因而难以对抗精子抗体等免疫性不孕抗体的分泌进行有效的抑制，而上述抗体则可对受精卵的形成和着床造成影响，引起不孕。目前对于由FcγRIIB水平下调直接或间接导致的疾病已有相关报道，周士亮等[12]报道，在原发性干燥综合征患者中，FcγRIIB的表达与SSDAI和抗SSA抗体呈负相关，FcγRIIB表达异常与免疫性疾病的发生有重要关系。

本研究同时发现，在相同DNA孵育浓度下，免疫性不孕症患者血清可溶性FcγRIIB与IC结合力高于正常人。人体血清中均含有一定量的IgG抗体和IC，血清与小牛胸腺DNA孵育后，IgG型IC含量可显著增加；在与可溶性FcγRIIB进行孵育后，二者可发生结合。与正常人相比较，免疫性不孕症患者血清中含有较多的抗精子抗体等类型抗体，在孵育后可产生更多的IgG型IC，因而可检测到FcγRIIB与IC结合力高于正常人。

在对免疫性不孕症患者体内AsAb等免疫性抗体进行检测显示，AsAb、AcAb和EmAb阳性率均显著高于正常人群。如前所述，上述抗体可对精子的输送、受精卵的形成、受精卵着床及发育等一系列过程造成影响，进而导致不孕症的发生。抗体由活化的B细胞产生，而FcγRIIB是抑制B 细胞激活的关键受体。在FcγRIIB水平下降后，其难以对B细胞的活化进行抑制，进而导致机体免疫耐受异常，上述抗体作用于精子、受精卵、子宫内膜以及胎盘血管，阻碍妊娠发生，引发不孕。不同类型的免疫性不孕症患者体内各种免疫性抗体的表达水平不尽相同，在原发性不孕患者中，AsAb阳性率较高；而继发不孕者，AcAb和EmAb阳性率较高。在精液中存在多种抗原，可与宫颈上皮细胞发生免疫反应，产生AsAb，进而阻碍精子进入宫腔、干扰精子获能、抑制顶体反应以及干扰精卵黏附与融合。而EmAb是内异症的标志抗体，在多次妊娠以及人流后，可刺激机体产生EmAb。而AcAb与免疫性疾病及多次流产有关，主要作用于血管导致胎盘供血不足而流产。但本研究显示，在生育力正常人群中仍存在一定比例的免疫性抗体阳性率，推测可能由于正常人FcγRIIB水平相对较高，可对机体免疫耐受进行调节，进而削弱了上述抗体的作用，不会对正常妊娠造成较大影响。

本研究通过对比检测免疫性不孕症患者与正常人血清可溶性FcγRIIB相关指标，对FcγRIIB在免疫性不孕症中的相关机制进行了分析。研究显示，免疫性不孕症患者FcγRIIB表达水平低于正常人。由于FcγRIIB下调可引起对B细胞活化的抑制作用不足，可能是导致免疫性抗体表达水平较高，进而导致不孕症的原因之一。关于FcγRIIB表达下调的机制有待进一步研究，而FcγRIIB有望成为免疫性不孕症治疗途径上的靶标分子。

[1] 孙莉,武军驻.抗精子抗体引起不孕不育的机制研究[J].检验医学与临床,2014,11(1):109-110.

[2] Chighizola CB,Pregnolato F,RaschiE,et al.antiphospholipid antibodies and infertility: a gene expression study in decidual stromal cells[J].Isr Med Assoc J,2016,18(3-4):146-149.

[3] 秦三利,杨志伟.抑制性受体FcγRIIB 的研究进展[J].免疫学杂志,2013,29(3):256-259.

[4] 吴艳,钟路.免疫性不孕不育的研究进展[J].中国热带医学,2011,11(3):385-387.

[5] 郑修军,王琦,曹秀琴,等.上调巨噬细胞FcγRIIB 的表达可抑制其吞噬和趋化功能[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(8):1022-1026.

[6] Ishikawa T,Takizawa T,Iwaki J,et al.Fc gamma receptor IIb participates in maternal IgG trafficking of human placental endothelial cells[J].Int J Mol Med,2015,35(5):1273-1289.

[7] Qian L,Chen W,Qin H,et al.Immune complex negatively regulates Toll-like receptor 9-mediated immune responses in B cells through the inhibitory Fc-gamma receptor IIb[J].Microbiol Immunol,2015,59(3):142-151.

[8] Lisi S,Sisto M,Lofrumento DD,et al.Advances in the understanding of the Fc gamma receptors-mediated autoantibodies uptake[J]. Clin Exp Med,2011,11(1):1-10.

[9] 赵成元,王丽,王华,等.免疫性不孕抗体阳性引发不孕症的临床诊治分析[J].中国妇幼保健,2013,28(28):4681-4682.

[10]马佳佳,Nick Lu,陈必良.IL-17R-FcγRIIb基因体外诱导树突状细胞表达及其对淋巴细胞增殖活化的影响[J].中国免疫学杂志,2013,29(11):1135-1141.

[11] 徐利玲.依赖于FcγRIIB穿膜区的新型B细胞活化抑制机制的研究[D].北京:清华大学, 2014.

[12] 周士亮,车楠,陆智敏,等.原发性干燥综合征患者外周血B细胞FcγRIIb的表达及临床意义[J].中华风湿病学杂志,2012,16(5):292-295.

Preliminary Study on Function and Mechanism of FcγRIIB in Immune Infertility Patients

JIA Li-juan1, CAO Xiu-qin2, WANG Qin3

(1.Department of Pathogenic Biology and Immunology,School of Basic Medicine,Ningxia Medical University, Yinchuan750004,China; 2.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance,Ministry of Education,Yinchuan 750004,China; 3.Deparmtent of Pathogenic Biology and Immunology, School of Basic Medicine,Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of the effect of FcγRIIB on immune infertility by detecting of immuno-antibodies and FcγRIIB in immune infertility patients and normal people.Methods30 cases of immune infertility patients were selected as observation group, and 30 cases of normal female as control group in the same period. The level of FcγRIIB, binding capacity with immune complexes(IC) and immuno-antibodies were detected by ELISA, and compared between the two groups.ResultsThe level of FcγRIIB in the observation group was lower than those of the control group(t=-9.528,P<0.0001), and the difference was statistically significant. The binding capacity with IC of FcγRIIB in observation group was higher than the control group at the same DNA incubation concentration. The positive rate of AsAb, AcAb and other immuno-antibodies in the observation group was higher than that of the control group(P<0.05), the difference was statistically significant.ConclusionThe decrease of expression level of FcγRIIB may be related to the occurrence and development of immune infertility.

infertility；immunologic factors；FcγRIIB；pathogenesis

1672-688X(2017)01-0018-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.006

2016-12-30

1.宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫系，宁夏银川 750004

2.宁夏医科大学生育力保持省部级共建教育部重点实验室，宁夏银川 750004

佳莉娟(1975—)，女，河南洛阳人，主治医师，从事感染与免疫研究工作。

王琦，男，教授，E-mail：wqmxm@126.com

R271.14

A

3.宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫系，宁夏银川 750004