陆维安

【摘 要】本文对在实验室进行植物组织培养中的预防污染问题进行了分析与阐述，重点介绍了植物组织培养过程中需要注意的有关操作问题，对相关的灭菌方法进行了说明。

【关键词】灭菌；组织培养；预防污染

植物组织培养是高中生物的重要课程之一，更是植物生理学的一种新兴技术，该技术广泛应用于生产与科研工作中，已形成自动化、规模化、控制化的培养模式。尽管在植物培养方面的有关理论和技术已比较完整，但在污染预防方面还需要更加深入的研究。

一、无菌操作与组织培养

在培养植物组织时，无菌培养与无菌操作是植物组织培养能否成功的关键。一方面要避免自来生物入侵实验室，比如环境、衣服以及皮肤等方面的微生物污染。另一方面要避免微生物感染实验者。实验室要预防真菌与细菌孢子的入侵，需要做好实验室内的清洁工作。在实验前要认真选择外植体，并对外植体进行灭菌处理。

二、外植体

在组织培养实验中，预防污染尤为重要，特别是在高温多雨季节，由于这些季节空气湿度大，微生物易滋生，无法采用一般的清毒措施对各种微生物进行有效控制。因此需要对外植体进行合适的选择，比如健壮植株以及成熟的种子等，并严格进行灭菌处理。

1.外植体的选择

在选择外植体时，实验者必须按照“易启动、污染少”的原则。植物体每一个部位都对培养工作的成功有着约定作用，比如茎段、茎尖的表皮与组织、块茎的花药、鳞茎、叶以及花瓣等。所选择的外植体应该是具有分生组织细胞并且不易污染的部分。同时，对外植体的应用，需要在无菌条件下进行预培养，事先冲洗枝条再插入自来水或营养液中，形成外植体，这样能够有效避免出现额外的污染。也可以将已经成熟的种子在完成消毒处理后制作成无菌苗，将芽苗的子叶、胚根以及胚轴作为材料，也能够对污染起到控制作用。另外外植体的采集工作也应在白天进行，相比于清晨，采集的外植体污染更小，因为外植体在阳光的照射下，细菌量会大幅减少。因此，在进行植物组织培养实验中，实验者需要选择表达能力强并且不易污染的外植体，以提高培养成功的概率。

2.外植体灭菌

外植体灭菌包含深灭菌与表面灭菌两种方法。叶片、茎段以及茎尖材料一般采用表面灭菌的方法进行灭菌处理，可先利用自来水进行冲洗，用软毛刷将表面的污渍除掉，再利用氯酸钠、氯化汞以等消毒剂进行浸泡，对于部分荚果类植物，由于灭菌难度较大，可以用氯化汞溶液进行灭菌处理。外植体的种类不同，灭菌的方法也存在着各自的差异，比如对于草莓茎尖组织，相关的灭菌方法涉及到5个不同的操作种类，比如次氯酸鈉灭菌、次氯酸钙灭菌、过氧化氢灭菌、新洁尔灭灭菌等，其中比较适用于高中实验的灭菌方式为前4种，但此4种灭菌方法需要较长的灭菌时间，但无论对实验者还是对接种材料来说都有着比较强的安全性保障。对于种子进行消毒处理，则可以选择比较传统的灭菌方法，常规的灭菌方法即利用次氯酸钠溶液对外植体进行长达30分钟的浸泡，必要时可选用升汞溶液进行5分钟的消毒处理。对于表面不光滑的材料，可以将少量表面活性剂溶于灭菌液中，以增大外植体与灭菌液之间的接触面积，对消毒效果起到良好的改善作用。

3.不同灭菌剂之间的对比

酒精：使用浓度为70%～75%，操作容易，灭菌时间为0.1～3分钟，灭菌效果较好；

氯化汞：使用浓度为0.1%～1%，操作较难，灭菌时间为2～10分钟，灭菌效果最好；

漂白粉：使用浓度为饱和溶液，操作容易，灭菌时间为5～30分钟，灭菌效果很好；

次氯酸钙：使用浓度为9%～10%，操作容易，灭菌时间为5～30分钟，灭菌效果很好；

次氯酸钠：使用浓度为1%～5%，操作容易，灭菌时间为5～30分钟，灭菌效果很好；

过氧化氢：使用浓度为10%～12%，操作最易，灭菌时间为3～5分钟，灭菌效果较好。

三、组织培养中的各环节操作

组织培养中不规范的人工操作是出现污染的主要原因，需要通过人工手段对可能出现的各种污染进行科学、有效的控制。产生污染的因素主要来源于培养工具与培养基，比如各种器皿、剪力以及镊子等；超净工作台的各种过滤装置在投入使用前没有进行充分的消毒处理；实验者自身没有严格按照有关规定来进行操作。对污染进行控制主要需要注意以下几方面的问题。

1.培养器皿与培养基的灭菌

综合运用各种手段对种子材料、操作工具以及培养器皿进行消毒处理。主要灭菌方法可以分为物理灭菌与化学灭菌两种，物理灭菌主要包含紫外线照射、烘箱干热以及高压蒸汽等。化学灭菌主要包含次氯酸钠、甲醛、漂白粉、新洁尔灭等灭菌方法。

2.特殊活性物质与激素的灭菌

部分外植体无法采用高温灭菌的方法进行处理时，可以采用吲哚乙酸、赤霉素等生长调节剂。对于部分通过乙醚进行灭菌的干燥物质操作处理，乙醚的去除需求在低温环境下进行，用无菌蒸馏水中进行多次冲洗，最后将外植体置于培养基中。

四、结束语

预防污染是植物组织培养成功的关键。作为高中生在组织培养实验过程中，要严格遵守实验规范，一定要做好消毒工作，在进行操作前需要进行如剪指甲以及洗手等方面的处理，提高操作安全性。