张迪，张雅敏，刘子荣，崔子林，李阳（.天津市器官移植重点实验室，天津009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 009；.卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 009）

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，AILD）是由自身免疫介导的肝胆系统慢性炎症性疾病，根据其临床表现、生化、免疫学、影像学和组织病理学特点可分为以肝细胞实质损害为主、血清肝细胞炎症指标明显升高的自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis， AIH）、以胆管病变为主、淤胆指标升高显著的原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis， PBC）、 原 发 性 硬 化 性 胆 管 炎（primary sclerosing cholangitis， PSC）及重叠综合征（overlap syndrome， OLS）4种类型。目前，临床上主要以糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗为主，但是对于部分AILD患者，其治疗效果欠佳，而且容易引起骨质疏松和恶性肿瘤等，且停药后易复发［1］。

间充质干细胞（mesenchymalstem cell，MSC）是一种具有全能干细胞特点来源于中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能，最初在骨髓中发现，在特定的诱导条件下可扩增为非造血组织干细胞［2-4］，具有免疫调节功能［5-6］。MSC 在体内外均可抑制T淋巴细胞的活化和增殖［7］，并可用于治疗多种疾病，均取得了较好的治疗效果。MSC的分化及免疫调节功能为其治疗AILD提供了可能性。

1 AILD的发病机制

AILD 可分为AIH、 PBC、 PSC、 OLS 4种类型，其中前3种较为常见。对于AILD的发病机制目前尚不明确［8-9］，学者们认为感染及抗原的分子模拟机制、自身免疫紊乱、遗传等因素相互作用，促进了AILD不同程度的进展［10］。

1.1 感染及抗原的分子模拟机制：抗原的分子模拟机制是指病原体上的抗原表位与人组织蛋白表位比较相似，当病原体感染机体时，机体激活淋巴细胞，产生抗体及组织抗原等物质，机体在抵抗病原体时，将正常组织误以为“异体”而进行攻击，导致正常组织器官受到一定程度的损伤［11］。研究结果显示，细菌感染、逆转录病毒感染、化学因素均与AILD的发病有关［12］。已有研究通过建立作用于DNA免疫的2型AIH鼠类动物模型证实了分子模拟机制在AIH发病中的作用［13］。Liang等［14］进行的一项Meta分析结果表明，泌尿系统感染与PBC发病有明显的相关性。

1.2 遗传因素：AILD有家族聚集现象，PBC及亲属的患病率比普通人群高100倍［15］，AIH、PSC也存在显著的家族成员集中发病现象。研究发现，人类组织相容性抗原（human lecocyte antigen， HLA）与其遗传易感密切相关［13］。由于遗传差异，AILD患者受到外界抗原刺激时更容易导致基因的异常表达，进而导致机体免疫状态紊乱，正常肝脏组织被识别为“异体”而发生免疫损伤。

1.3 自身免疫紊乱：AILD的免疫损伤主要有细胞免疫和体液免疫2种方式。细胞免疫是指特异性抗原刺激机体可激活CD4+T细胞，进而释放一系列免疫调控因子，活化细胞毒性T淋巴细胞，释放毒性因子直接破坏肝细胞；体液免疫是指抗原刺激机体，B细胞产生大量针对自身肝细胞或胆管细胞的抗体，与细胞膜上的蛋白成分结合，介导细胞毒性作用导致肝脏、胆管的损伤。AIH患者肝脏组织表现为淋巴细胞、效应B细胞、巨噬细胞等浸润，表明其发病与免疫有关［16］。Th17细胞/调节性T细胞比例失衡导致患者免疫耐受机制被破坏，参与了AILD的发生［17］。Th17细胞分泌的主要细胞因子为白细胞介素 -17（interlenkin-17， IL-17），其在免疫调节中发挥重要作用，IL-17在辅助性T细胞（Tfh）的产生中发挥重要作用，IL-17可以激活B细胞、促进效应B细胞分化，促进CD8+T细胞及免疫细胞的活化，对免疫球蛋白也有一定作用。研究发现，PBC患者中CXCR5+CD4+T细胞数量增加，IL-17因子水平提高［18］。此外，也有研究发现，AILD患者体内转化生长因子（transforming growing factor-β1， TGF-β1）水平下降，导致免疫负调控下降，免疫反应亢进促进AIH和PBC的发展［19］。

2 MSC的免疫调节作用

MSC是具有多种分化潜能的非造血干细胞，它具有来源丰富、分化潜能高及免疫调节特性［20］，现已引起干细胞治疗领域专家浓厚的兴趣［21］。MSC低度表达MHCⅠ，不表达MHCⅡ、CD40、CD40L、B71、B72等共刺激因子，这些特点使MSC可逃避免疫系统的监视，进入体内，而不会遭受机体免疫系统的排斥［22］。MSC几乎影响固有免疫系统和获得性免疫系统的每个环节［23-25］，它可以调节巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞，在调节固有免疫及保护组织免受损伤中起到重要作用。另外，MSC还可以抑制B细胞及T细胞，在获得性免疫中起到调节作用［26］。MSC主要通过细胞之间的相互接触以及分泌的可溶性因子发挥其免疫调节作用［21，27-28］。MSC对T细胞、B细胞、NK细胞及树突状细胞等抗原提呈细胞的增殖与分化有重要的调节作用，MSC可以促进T细胞分化为调节性T细胞（T-regulatory lymphocytes，Tregs）和 Th2，抑制 Th17和 Tfh反应，并可以抑制单核细胞向抗原提呈树突状细胞分化［29］。MSC在体内下调Th1和Th17细胞相关细胞因子γ-干扰素（interferon-γ， IFN-γ）和IL-17的表达水平，同时上调Th2和Treg细胞相关细胞因子IL-10和TGF-β的表达水平。有研究表明，吲哚胺2，3-二加氧酶IDO，前列腺素PGE2，一氧化氮（NO）、人类白细胞抗原（HLA-DR）和趋化因子等因子也参与MSC的免疫调节作用［30-31］。建立T细胞和MSC的混合培养体系，MSC通过产生Treg细胞和分泌细胞因子TGF-β和PGE2抑制T 细胞的增殖和活化［30］。Kol等［32］将 MSC 静脉注射至健康马体内，观察白细胞、脾脏淋巴细胞、血淋巴细胞以及各种细胞因子的变化情况，结果发现MSC可以上调血中CD8+T细胞及脾脏中FoxP3+Treg细胞的水平。MSC可产生和分泌多种细胞生长因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纤维母细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）、胰岛素样生长因子 - 1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等。另外，MSC具有组织修复能力，组织出现损伤后，MSC可以迁移到损伤部位，在局部环境的调控下，发挥免疫调节及分化等功能，参与组织的修复过程中［33］。

3 MSC对AILD的作用

随着对MSC研究的深入，MSC已应用于多种免疫性疾病的治疗，尤其对失代偿期肝硬化、AILD患者的临床应用及研究， 已成为时下的热点问题。肝细胞具有一定的再生能力，肝细胞受到轻度损伤时，可通过增殖进行修复；而肝细胞损伤较重或受到持续的损伤时，肝脏干细胞被激活并参与到损伤修复中；当损伤程度超过肝细胞和肝脏干细胞修复能力时， 骨髓干细胞（包括造血干细胞、 MSC和内皮祖细胞等）被募集至损伤部位并发挥重要的修复功能［34］。MSC可转分化为肝细胞以增加功能肝细胞的数量，也可通过与肝细胞融合促进损伤肝细胞的修复和功能的恢复［35］。钟艳等［36］通过四氯化碳（CCl4）法建立大鼠肝损伤模型，分离肝损伤大鼠血清并诱导脐带MSC分化，检测培养液上清甲胎蛋白和白蛋白水平。肝损伤大鼠血清可使脐带MSC向肝样细胞分化，经诱导后培养液上清中白蛋白水平增高。研究表明，MSC通过分泌多种细胞因子改变了肝脏局部的免疫微环境，进而促进了肝细胞的损伤修复和功能恢复［37］。低免疫原性MSC可用于异体移植并促进受体肝的损伤修复。

3.1 MSC治疗安全性研究：MSC的安全性是MSC治疗各种免疫性疾病的基础。Kol等［32］将MSC静脉注射至正常马体内，观察其性情、体温、脉搏、体温等变化，发现静脉注射MSC后随访1周，健康马并未出现临床异常，MSC不能导致炎症反应，未见组织及器官毒性，MSC无明显临床不良反应。在几个临床试验中，研究人员验证了异体或自体同源MSC的有效性和安全性［38-39］。de Windt 等［40］分离骨髓间充质干细胞（bone marrow-drived mesenchymal stem cell， BM-MSC）用于治疗软骨缺损患者。Xu等［41］将脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell， UC-MSC）输入干燥综合征（sjogren's syndrome，SS）患者体内。研究人员选取了10例熊脱氧胆酸（UDCA）治疗无效的PBC患者给予MSC治疗随访1年后均未发现明显不良反应［30］。随着实验研究及临床试验不断证实MSC治疗的安全性，研究MSC对AILD治疗作用的障碍慢慢减少，MSC的特点、安全性促使学者们逐渐深入研究其在AIH中的免疫调节作用［26］。

3.2 MSC治疗AILD的实验研究：MSC的免疫调节作用在很多免疫性疾病如类风湿关节炎［42-43］、糖尿病［44］、辐射诱导的肝损伤［45］的动物模型中得到证实。有学者建立了大鼠CCl4肝纤维化模型后，肝纤维化大鼠的肝小叶结构被破坏，肝脏细胞的胞质出现空泡和脂肪滴，丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸转氨酶（asparate transaminase， AST）水平明显升高，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA：检测肌纤维母细胞样细胞的细胞表面标记）阳性细胞增多，而经MSC治疗的肝纤维化小鼠，其ALT、AST水平无明显升高，肝小叶以肝中央静脉为中心放射状排列，仅少量肝脏细胞出现空泡及脂肪滴，α-SMA阳性细胞数与正常大鼠相比无明显升高［46］。MSC能够维持血清蛋白水平稳定，抑制转氨酶被激活，抑制损伤肝脏纤维化。MSC可以分化为类肝脏细胞修复受损的肝细胞及纤维化肝脏，进而促进肝功能的恢复。Chen等［47］建立小鼠实验性自身免疫性肝炎（experimental autoimmune hepatitis， EAH）模型，并分为正常组、模型组、药物治疗组、MSC治疗1组、MSC治疗2组、MSC治疗3组共6组，正常组不进行造模，模型组在造模后仅腹腔注射1 ml生理盐水，药物治疗组腹腔注射泼尼松龙及硫唑嘌呤，MSC治疗1组、MSC治疗2组、MSC治疗3组分别给予1、2、3次MSC治疗。42天后取动物小鼠血液及肝组织，分析ALT、AST水平，蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞因子IL-17、IL-23水平，PCR检测程序性死亡受体配体1（PD-L1）的mRNA水平，研究结果显示，造模后血清中ALT、AST水平增高，而MSC治疗组可明显降低其水平。IL-17是CD4+T细胞如Th17细胞分泌的致炎因子之一，Th17细胞和IL-17在自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用［48-49］，与正常组相比，EAH小鼠IL-17的表达水平明显增高，而经MSC治疗后，IL-17表达水平显著下降，且随治疗次数增加下降更明显，IL-17下降水平与PD-L1水平呈明显负相关，推测MSC通过激活PD-L1表达而抑制IL-17的表达，进而抑制炎症反应，起到治疗EAH作用。Wang等［50］腹膜下注射聚肌胞苷酸建立小鼠PBC模型，经MSC治疗后，胆管周围单核细胞浸润减少，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、ALT等血清转氨酶及抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）、抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）等自身抗体水平降低，外周血及淋巴结中CD4+Foxp3+T细胞数量增多，血清TGF-β1表达水平增高，而IFN-γ表达水平下降。可见，MSC可以调节免疫应答，抑制肝脏炎症反应，这些研究预示MSC以后可能应用于临床治疗AILD。

3.3 MSC治疗AILD的临床进展：100所自身免疫性疾病研究试验基地中有22所基地研究了MSC的疾病治疗作用［38-39］。初期临床试验在激素难治性Crohn病［51］、激素抵抗型移植物抗宿主病［52］、多发性硬化［53］、酒精性肝硬化［54］等疾病中体现了MSC的免疫调节作用，MSC对肝移植后急性排斥的调节作用正在研究中［26］。PBC是一种慢性进行性胆汁淤积性AILD，目前主要治疗为UDCA，对于UDCA治疗无效的PBC患者，治疗是临床上较为棘手的问题。有研究选取了10例UDCA治疗无效的PBC患者，给予MSC治疗，随访1年，进行PBC-40问卷分析患者生活质量，检测患者血清中ALT、AST、ALP、γ-转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、 总 胆 红素（total bilirubin，TBiL）、间接胆红素（indirect bilirubin，DBiL）、免疫球蛋白（IgM）水平及IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF-α），TGF-β1 等因子变化，分析外周血淋巴细胞表型，研究结果发现，PBC患者经MSC治疗后，ALT、AST、γ-GT、IgM表达水平较治疗前明显降低［30］。外周血淋巴细胞中CD8+T细胞数量减少，与此同时，CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量增多。IL-10表达水平升高，验证了MSC在UDCA难治性PBC患者中的免疫调节及治疗作用。Wang等［55］用UC-MSC治疗7例UDCA难治性PBC患者，发现经治疗后ALP、谷氨酰转肽酶降低，Mayo风险评分（mayo risk score， MRS）可以评估PBC患者生存率，同样说明了MSC治疗的安全性及有效性。吕胜祥等［56］从外周静脉输注MSC，观察了6例AILD患者的肝功能变化及治疗后的安全性情况，经治疗后6例患者均达到临床病情缓解标准，血清白蛋白水平较治疗前明显升高，ALT和AST水平低于治疗前，治疗后无严重并发症发生。

4 小 结

AILD是由自身免疫介导的肝胆系统的慢性炎症性疾病，目前，临床上主要以糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗为主，但是对于部分AILD患者，其治疗效果欠佳，而且此类药物易引起骨质疏松和恶性肿瘤等，且停药后易复发［1］。AILD与机体免疫紊乱有关，而MSC的低免疫原性、免疫调节等生物特性及组织损伤修复功能为AILD治疗提供了新途径。但目前AILD的发病机制及MSC免疫调节及修复受损肝脏组织的机制还不明确。另外，实验研究及临床试验相对缺乏，MSC治疗AILD的剂量及远期安全性问题需要进一步研究。随着组织工程学的快速发展及细胞治疗的不断成熟，在不久的将来，上述问题将在研究中不断解决。相信MSC将给难治性AILD患者带来希望，也将更好地应用于临床，为患者服务。