胡韵仪，侯丽淳，季方茹，潘洪秀

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

佳木斯地区MTHFR基因多态性与缺血性脑卒中的关系分析①

胡韵仪，侯丽淳，季方茹，潘洪秀

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨佳木斯地区亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与缺血性脑卒中的关系。方法：选取缺血性脑卒中患者181例为实验组，健康体检者169例为对照组。通过荧光原位杂交法检测实验组和对照组MTHFRC677T、A1298C位点基因多态性。结果：实验组和对照组MTHFRC677TCC、CT、TT基因型比例分别为17.68%/20.71%、37.02%/47.34%、45.30%/31.95%，两组差异有显著性(P<0.05)；MTHFRA1298CAA、AC、CC基因型比例分别为58.56%/58.58%、37.02%/38.46%、4.42%/2.96%，差异没有显著性(P>0.05)。结论：MTHFRC677T基因多态性与缺血性脑卒中具有相关性，T等位基因可能是缺血性脑卒中的易感基因；MTHFRA1298C基因多态性与缺血性脑卒中没有关系。

缺血性脑卒中；MTHFR；基因多态性

脑卒中，又称中风或脑血管意外，是由于脑部供血受阻而迅速发展的脑功能损失。可因血栓或栓塞所造成的缺血或出血引起。其中缺血性脑卒(IschemicStroke，IS)中约占60%～70%。它是一大类严重威胁着人类健康和寿命的常见疾病[1]，其发病机理尚不完全明了，有待于进一步进行研究探讨。

亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene-tetrahydrofolatereductase,MTHFR)，是叶酸(FolicAcid)代谢过程中的关键酶。该酶遗传缺陷则引起叶酸代谢中5,10-亚甲基四氢叶酸不能还原成5-甲基四氢叶酸，因而不能为同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)代谢途径中合成蛋氨酸和DNA合成提供甲基供体，使Hcy代谢受阻，导致体内Hcy水平的升高[2～4]。同型半胱氨酸可对血管内皮产生毒性作用，促进动脉斑块的形成，干扰血管平滑肌的正常功能[5～7]。MTHFR是一种酶蛋白，在体内的合成受MTHFR基因调控，当基因发生变异时，MTHFR酶蛋白合成受阻，引起酶含量减少，从而引起代谢异常。人类MEHFR基因具有两千多个变异位点(NCBISNP收载)，目前研究较多的是MTHFRC677T(rs1801133)以及A1298C(rs1801131)基因位点的突变，二者的突变可导致血浆高同型半胱氨酸和低叶酸状态[2]。国内外已有文献报道C677T以及A1298C基因位点的突变与脑卒中相关[3，8，9]，同时也有不相关的报道[10，11]。为了探讨MTHFR基因多态性是否具有相关性，我们选择佳木斯地区脑卒中人群使用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)法进行MTHFR基因多态性检测，以确定其与脑卒中的相关性，并为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015-10～2016-06来院就诊的脑卒中患者181例为实验组，其中男136例,女45例，年龄40～72岁，平均(53.13±5.09)岁，所有患者均符合中华医学会神经病学分会-各类脑血管病诊断要点要求，均行头颅CT和(或)MRI检查，并确诊为缺血性脑卒中诊断；病例之间无血缘关系，有当地户籍，居住10年以上；均签署知情同意书。同时选取本院体检健康人169例为对照组，其中男94例，女75例，年龄40～64岁，平均(52.37±4.42)岁，排除冠心病、高血压、脑血管疾病等。实验组与对照组差异没有显著性。

仪器：TL-988实时荧光定量PCR仪(西安天隆科技仪器有限公司)，荧光原位杂交DNA测序分析程序(北京华夏时代基因科技发展有限公司)，HC-3017高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)，1～1000μLFINNPIPETTE移液器(Thermoscientific公司)。

试剂：PHARM-GENE01SNP分析保存液，PHARM-GENE200MTHFRC677T、A1298CSNP分析样品处理试剂(北京华夏时代基因科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 富集白细胞

取150μL新鲜全血加入含有1000μL氯化铵溶液的1.5mL塑料试管中，颠倒混匀后室温放置10min，3000r·min-1离心5min，用移液器吸出上清液。

1.2.2 加样

在富集了白细胞的管中加入100μL耀金保，震荡混匀，室温放置20～30min。吸取本液1.0～1.5μL加入待测基因对应的耀金分试剂中，漩涡混匀，瞬时离心，上机检测。在样品检测的同时，加测3种不同基因型的质控品作为对照。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件对实验组与对照组检测结果进行卡方检验，以P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有高度显著性。

2 结果

2.1 基因型分析

根据与试剂随行的软件设定液和三种基因型质控品显示的图谱及St值(荧光曲线出现拐点时的循环数)设定软件参数，参数设定后，试验样品自动显示测定结果的基因型。

MTHFRC677T、A1298C拟合曲线见图1。

图1 MTHFR C677T三种基因型和MTHFRA1298C三种基因型拟合曲线图

2.2 基因型检测结果

本实验使用荧光原位杂交法检测MTHFRC667T、A1298C两个位点，共检测脑卒中患者(实验组)血样181份，健康对照组169份，见表1。

表1 MTHFR C677T、A1298C基因型检测结果

由检测结果通过卡方统计分析可见，实验组与对照组MTHFRC677T不同基因型差异有显著性，(χ2=6.865,P<0.05)，等位基因差异有高度显著性，(χ2=12.84 ，P<0.01)。实验组TT基因型及T等位基因频率均高于对照组(45.30/31.95、63.81/55.62)实验组CC、CT基因型均低于对照组(17.68/20.71、37.02/47.34)，实验组C等位基因低于对照组(36.19/44.38)。表明T等位基因为脑卒中易感碱基。实验组与对照组MTHFRA1298C不同基因型及不同碱基差异没有显著性，将含有变异碱基AC和CC合并后差异也没有显著性(P>0.05)。

3 讨论

目前，基因多态性对疾病易感的影响是精准医学重点研究的内容，在基因多态性对脑卒中易感的关系研究中，MTHFR基因多态性是一个主要方面，但是研究结果不尽相同，武汉大学的韩瑞玲[3]、郑州大学的施梦丽[8]、天津第一中心医院Bao-ShengZhou[9]等人的研究认为MTHFRC677T的TT等位碱基是脑卒中的易感基因(P<0.01),本研究结果与其一致；但同时河南科技大学的肖湘雪等人的研究却显示MTHFRC677T基因多态性对脑卒中没有影响，实验组与对照组差异没有显著性(P>0.05)。天津第一中心医院Bao-ShengZhou[9]等人的研究认为MTHFRA1298C的CC基因型为脑卒中的易感基因(P<0.01)，而布加勒斯特维克多儿童病理学研究所的ArseneD等研究却认为MTHFRA1298C实验组与对照组几乎没有差异(P>0.05)，既MTHFRA1298C基因多态性与脑中风没有关系，与本实验结果一致。

由于各个研究者选取的病例数及对照组例数均不超过600例，所得研究结果不足以作为临床诊断的依据，因此有必要进行大样本分析研究，以为临床诊断提供实验室依据。

[1]荆鑫鑫，刘鸿飞，朱金玲,等.初发和复发性脑梗死患者血清同型半胱氨酸水平的临床研究[J].黑龙江医药科学，2014,37(5)：33-36

[2]张爽，鲁衍强，芮欣忆,等.不同5，10_亚甲基四氢叶酸还原酶基因型人群叶酸补服效果评价[J].天津医药，2013，41(7)：628-631

[3]韩瑞玲,李艳.武汉地区缺血性脑卒中患者MTHFR基因多态性分布分析[J].神经损伤与功能重建，2016,11(3)：200-202

[4]和梅，徐金铭，王欣.叶酸联用维生素B12对丙戊酸钠治疗的癫痫患者血同型半胱氨酸水平的影响[J].黑龙江医药科学，2016,39(2)：53-54

[5]张成发，王复新，吴丽莉,等.315例缺血性脑卒中危险因素Logistic回归分析[J].黑龙江医药科学，2015,38(2)：153-155

[6]杨波，杨树忠，卢志刚,等.同型半胱氨酸与颈动脉狭窄支架置入术后再狭窄程度的相关性[J].黑龙江医药科学，2014,37(6)：102-104

[7]高雨田，彭鹏，褚春沐,等.42例脑梗死患者血清同型半胱氨酸水平研究[J].黑龙江医药科学，2015,38(1)：86-87

[8]施梦丽，弓园芳，陈淅泠.同型半胱氨酸浓度及MTHFR基因多态性与缺血性脑卒中的相关性[J].中国神经疾病杂志，2014,17(17)：53-54

[9]ZhouBS,BuGY,LiM,etal.TaggingSNPsintheMTHFRgeneandriskofischemicstrokeinaChinesepopulation[J].IntJMolSci，2014, 15(5):8931-8940

[10] 肖湘雪,白淑凤.MTHFR基因多态性与脑卒中的关系研究[J].中国实验诊断学，2012,16(7)：1311-1313

[11]ArseneD,GinG,BlescuC,etal.C677TandA1298Cmethylenetetrahydropholatereductase(MTHFR)polymorphismsasfactorsinvolvedinischemicstroke[J].RomJMorpholEmbryol，2011,52(4):1203-1207

The analysis of polymorphism relationship of MTHFR gene and ischemic stroke in jiamusi

HUYun-yi,HOULi-chun,JIFang-ru,PANHong-xiu

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To analyze polymorphism relationship of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)gene and ischemic stroke patients in Jiamusi. Methods: Total 181 cases of ischemic stroke patients were enrolled as experimental group, and 169 healthy cases were enrolled as control group. MTHFR C677T、A1298C genotypes were detected by the Fluorescence by situ hybridization method. Results: In the experimental group and control group, MTHFR C677T genotype proportions were CC for 17.68%/20.71 %, CT for 37.02%/47.34%, TT for 45.30%/31.95%. Compared experimental group with control group, there was a significant difference (P<0.05);andMTHFRA1298CgenotypeproportionswereAAfor58.56%/58.58%;ACfor37.02%/38.46%;andCCfor4.42%/2.96%.Thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05). Conclusion: MTHFR C677T polymorphism and ischemic stroke are relevant. T allele may be a susceptible gene for ischemic stroke. MTHFR A1298C polymorphism is not associated with ischemic stroke.

ischemic stroke; MTHFR; gene polymorphism

胡韵仪(1990～)女，黑龙江佳木斯人,在读硕士研究生。

候丽淳(1971～)女，黑龙江佳木斯人，硕士， 副主任医师，硕士研究生导师。E-mail：1312755739@qq.com。

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1008-0104(2017)01-0089-03

2016-10-09)