杨 平, 蒲相君, 时婷婷, 王忠文, 张君成

(广西大学农学院, 南宁 530004)

一种防止培养基平板被污染和干燥的简易方法

杨 平, 蒲相君, 时婷婷, 王忠文, 张君成*

(广西大学农学院, 南宁 530004)

在植物病原菌的常规培养中,经常会遇到杂菌污染和培养基干燥的问题。本文介绍一种简易而有效的解决方法,其要点是利用密封式普通塑料保鲜盒盛放培养基平板,再转移到培养箱中培养。该方法特别适合需要长期培养的测试工作。除了平板培养外,该方法还可用于其他形式的培养,以防止培养皿内试验材料的水分散失和杂菌污染。

病原菌; 培养; 污染; 水分散失

在植物病害试验研究和产品研发工作中,平板培养是一项最基本而常用的方法,其主要程序是,将培养基倒入培养皿制备平板,植入病原菌后置于培养箱中培养。平板培养的工作原理是培养皿盖罩住皿底后,在培养皿内形成一个无菌小空间,病原菌在此空间内生长发育。当前的制造技术几乎无法保证皿底与皿盖之间的盖合达到无缝贴合,造成培养皿内外容易交换空气,实验室的螨虫也可通畅无阻地进入其中。因而,皿内小空间的无菌状态非常容易受皿外环境的干扰,而目前国内普通实验室的场地及装备环境基本上属于开放型,腐生微生物及螨虫遍布室内,导致培养平板容易污染。文献一般未提及该问题,但也有研究报道特别指出和强调污染对平板培养的影响[1]；另一方面,目前实验室常用的培养箱多属循环空气式培养箱,运行过程经常需要加热/制冷,导致箱内工作室空气相对湿度可低至40%以下,非常干燥,容易造成平板培养基的污染和干燥。降低污染率和延缓培养基失水,提高平板培养的质量,是植物病原菌日常培养工作的基本要求。本试验利用保鲜密封盒这一简易装置达到了理想效果。

1 器具与方法

1.1 器具

主要器具为市面上常见的一种简单的家用塑料保鲜密封盒,保鲜盒由盒主体和盒盖构成,盒主体上有4个扣突；盒盖上有4个相应的扣钩以及卡槽与密封胶(图1)。

1.2 操作方法

按常规的无菌操作方式,在超净工作台上将培养基倒入培养皿制成平板,并在平板上植入待培养的病原菌。

正置使用保鲜盒方法:将保鲜盒与洁净的普通塑料袋置入超净工作台。在无菌条件下将已接菌的培养基平板先装入塑料袋内,再放入保鲜盒,盖上盒盖,并将盒盖的扣钩紧扣于盒主体的扣突上(图2)。

倒置使用保鲜盒方法:将保鲜盒放入超净工作台,打开盒盖并倒置于工作台面上(盖的内面朝上),将已接菌的培养基平板放于盒盖上,用保鲜盒主体罩住培养皿,并将盒主体的开口边缘卡入盒盖的卡槽内,将盒盖的扣钩压扣于盒主体的扣突(图3)。

将装有培养基平板的保鲜盒从超净工作台转到常规恒温培养箱,在需要的培养条件下培养。

图1 塑料保鲜盒的构成与外观Fig.1 Structure and appearance of plastic storage box

图2 保鲜盒正置使用示意图Fig.2 Diagram for using storage box in normal manner

2 应用实例与结果

2.1 在螨虫污染的培养箱中应用

以空白PSA培养基平板作材料,按保鲜盒倒置使用方法将12皿分3个盒装,4皿/盒。以常规纱布捆包式和膜封口式的培养方法作对照。纱布捆包法用一层普通纱布捆包培养平板4皿/包,共3包；膜封口法是将Parafilm(Pechiney plastic packaging)封口膜剪成条片,取条片将12皿培养平板逐个封口,然后4皿放成一叠,分3叠置于浅盘上。全部处理均在超净工作台上完成,并全转到同一个因长期培养作业而存在螨虫污染的培养箱(珠江牌LRH-150-HS培养箱),置于同一架层上,在温度28℃并加湿条件下培养。

图3 保鲜盒倒置使用示意图Fig.3 Diagram for using storage box in inverted manner

培养结果显示,纱布捆包法培养3 d后,12皿培养平板全被杂菌污染,并且留下明显的螨虫走动轨迹(图4a)。封口膜处理培养3 d后只有1皿被杂菌污染,6 d后突增到10皿污染,并同样有明显的螨虫走动轨迹(图4c),仔细观察发现,封口膜有些地方出现了裂缝(图4d)。而保鲜盒装法培养9 d后(图4b)仅有2皿污染(表1),且仅有个别杂菌小菌落,没有明显的螨虫走动轨迹。很明显,保鲜盒装载式的培养方法预防螨虫为害污染的效果理想。

图4 空白培养基平板以不同方法培养的结果Fig.4 Culture result on empty medium plate by different methods

培养时间/dCulturetime12皿平板的污染数量/皿No.ofdishwithcontaminationin12plates保鲜盒装法Storagebox封口膜法Parafilm纱布捆包法Cheesecloth30112601012921112

2.2 不同方法培养稻曲病菌

在PSA平板上植入稻曲病菌后,采用保鲜盒正置使用方法处理12皿；用纱布捆包法处理12皿,一起转到正常空气循环式培养箱(珠江牌LRH-250-G培养箱)内同一架层上,在温度为28℃及不加湿的条件下培养。

纱布捆包法培养5 d后观察到杂菌污染和培养基细小干裂现象,10 d后出现较大的干裂裂缝(图5a～b),15 d后大部分平板被污染并干裂。而保鲜盒装法培养的,仅在15 d后出现1皿被污染(表2),且全部12皿平板没有干裂的迹象。表明保鲜盒装法培养,能大幅降低污染率和防止培养基干燥。

图5 培养稻曲病菌10 d后的菌落与平板Fig.5 Colony of Ustilaginoidea virens growing for 10 days and medium plate

培养时间/dCulturetime保鲜盒装法培养12皿 12dishesgrownbystoragebox污染皿数/皿No.ofdishwithcontamination干裂皿数/皿No.ofdishwithcracking纱布捆包法培养12皿 12dishesgrownbycheesecloth污染皿数/皿No.ofdishwithcontamination干裂皿数/皿No.ofdishwithcracking5003410007915101012

2.3 长期培养稻曲病菌的效果

将稻曲病菌移入PSA平板,用保鲜盒正置使用方法,在循环空气式培养箱(珠江牌LRH-250-G培养箱)连续培养90 d,12个重复。结果,除3皿出现污染外,其余完好,而且所有培养基平板仍表现厚实充润,观察不到干燥迹象(图6)

3 讨论

尽管平板培养的污染和培养基易干燥问题一直存在,但还未见有较好的应对方法,目前主要的解决方法是利用Parafilm封口膜或其他胶膜将培养皿封口[2-5],该方法能有效地降低污染率并减少培养基水分散失。不过,目前实验室通常使用的Parafilm封口膜是长片成卷的膜产品,使用时,需要先裁剪成适合粘贴的条片状,然后取该条片状的封口膜在培养皿的开口周缘表面逐个拉伸粘贴,操作相当繁琐,在培养量较大时,封口程序工作效率低,实践操作非常不便；而且,在培养箱内培养一段时间后,封口膜容易出现开裂现象(图4 d),而封口膜一旦开裂,其防虫、防污染、防失水效能随即下降,这是本文试验2.1使用封口膜封口而仍然出现污染率高的原因(表1)；虽然增加贴膜层数能减少开裂的可能,但也增加了工作的繁琐性。

利用普通塑料保鲜盒装载培养平板的方法虽然很简单,但预防螨虫干扰和杂菌污染,以及防止培养基干燥方面却非常有效。其原因是保鲜盒盖的卡槽上配备一圈密封胶(图1),该密封胶使得盒盖与盒主体扣紧后,盒内外达到密不透气的技术状态。这种保鲜盒虽然已在国内日常家庭生活中普遍使用,但其优越的密封性一直没有引起实验室的注意,也未见报道被实验室所利用。市面上的保鲜盒各式各样,并非所有式样的保鲜盒均具备可靠的密封性能,一个简单的检验方法是将保鲜盒进行装水检漏,密封性能好的能滴水不漏。

图6 保鲜盒法培养90 d后的稻曲病菌菌落与培养平板Fig.6 Colony of Ustilaginoidea virens growing for 90 daysand medium plate by using method of storage box

在超净工作台上开合保鲜盒,能使得盒内空气接近无菌状态,转到培养箱后,尽管培养箱工作室内空气流动属于常态,但保鲜盒内的空气却相对静止,密封胶也阻止盒内外空气的交换,从而保证盒内培养平板处于一个相对洁净并湿度恒定的局部小空间环境,直至培养作业结束,因而保鲜盒具有预防污染和水分散失的理想功效。

正置使用保鲜盒,从较狭窄的盒主体中放入/取出培养皿颇有难度,因而先将培养皿放入干净的普通塑料袋内,然后拎着塑料袋, 再放入或取出就很方便(图2),这里增加的塑料袋,还具有缓冲培养皿在保鲜盒内松动滑移的好处；所用塑料袋以新购的为宜、一次性使用。在倒置使用保鲜盒的情况下,盒主体以倒置的形式与盒盖扣合,无需借助塑料袋,就能方便地取放培养皿。保鲜盒可反复使用,必要时可用清水冲洗晾干后备用,但不宜高温灭菌,因高温后密封胶容易丧失密封性能。

经作者反复测试,结果均表明采用保鲜盒装载法培养稻曲病菌,对稻曲病菌的生长发育并没有不良的影响。不过,考虑到该方法利用的是保鲜盒的密封性；对通透性敏感的病原菌可能不适用该方法进行日常培养；因此,实际使用时,应先行测试明确适用与否。

在植物病理学研究中,经常需要进行较长时间的培养,如有关报道在分析温度对苹果炭疽叶枯病菌Glomerellacingulata子囊壳形成的影响测试中,观察培养了29 d[6]；一些生长缓慢的病原真菌,如稻曲病菌Ustilaginoideavirens[7]、苹果褐斑病菌Marssoninacoronaria[1]、花生褐斑病菌Cercosporaarachidicola[8]等,要获得较大的菌落,往往也需要长时间的培养,其中的杂菌污染和培养基失水问题非常突出,用保鲜盒装载培养的方法对解决此问题特别有效,本文的试验2.3是个佐证。需要指出,培养中途的观察,最好将装载材料的保鲜盒转移到超净工作台,并在工作状态下打开保鲜盒取出材料观察。

研究者在利用培养皿开展其他与植物病害有关的试验,如线虫的生物防治测试[9]、苹果腐烂病菌Valsaceratosperma侵染性测试[10]、芹菜软腐病Pectobacteriumcarotovorumsubsp．odoriferum的离体叶接种测试[11]、草坪禾草币斑病菌Sclerotiniahomoeocarpa的离体叶接种测试[12]等时都强调使用Parafilm封口膜将培养皿封口,以预防污染和水分散失,这些有关试验值得试用本文报道的方法,尤其是在培养皿内盛装的是液体材料[9],或者是已经接种病菌的寄主离体器官材料[12],需要保持培养皿平置状态,此时用Parafilm封口膜封口需要非常小心细致的操作,应用本方法或许更为便捷,不过实际应用时最好也先行测试本方法的适用性。

本文报道的方法除了能解决污染和失水问题外,所用的保鲜盒实际上属于稳固的装载器具,明显有利于材料的移动操作,如将培养皿从工作台转移到培养箱,或从培养箱转移到结果检测平台等；也便于培养皿在培养箱中整齐多层叠放,充分利用培养箱内作业空间。

[1] 赵华, 黄丽丽, 谢芳芹, 等. 苹果盘二孢的分离培养研究[J]. 菌物学报, 2009, 28(4): 490-495.

[2] 戚仁德, 汪涛, 李萍, 等. 安徽省辣椒疫霉交配型的分布及在无性后代的遗传[J]. 植物病理学报, 2012, 42(1): 45-50.

[3] 马国胜, 高智谋. 烟草黑胫病菌培养性状的研究[J]. 中国农业科学, 2007, 40(3): 512-517.

[4] LeBoldus J M, Blenis P V, Thomas B R. A method to induce stem cankers by inoculating nonwoundedPopulusclones withSeptoriamusivaspore suspensions [J]. Plant Disease, 2010, 94(10): 1238-1242.

[5] Hu Jia, Pang Zhili, Bi Yang, et al. Genetically diverse long-lived clonal lineages ofPhytophthoracapsicifrom pepper in Gansu, China [J]. Phytopathology, 2013, 103(9): 920-926.

[6] 王冰, 张路, 李保华, 等. 温度、湿度和光照对苹果炭疽叶枯病菌(Glomerellacingulata)产孢的影响[J]. 植物病理学报, 2015, 45(5): 530-540.

[7] 王疏, 白元俊, 周永力, 等. 稻曲病菌的病原学[J]. 植物病理学报, 1998, 28(1): 19-24.

[8] Starkey T E. A simplified medium for growingCercosporaarachidicola[J]. Phytopathology, 1980, 70(10): 990-991.

[9] 张树武, 徐秉良, 古丽君, 等. 长枝木霉对禾谷胞囊线虫卵的寄生和毒杀作用及其机制[J]. 植物保护学报, 2013, 40(4): 320-326.

[10]刘斐, 谭贻, 王忆, 等. 苹果腐烂病菌侵染过程中枝条相关病程物质含量的变化[J]. 中国农学通报, 2015, 31(34): 177-186.

[11]王茜, 张宝海, 赵亮, 等. 一株芹菜(ApiumgraveolensL.)软腐病菌Pectobacteriumcarotovorumsubsp.odoriferum的特征[J]. 植物病理学报, 2015, 45(4): 418-424.

[12]Liberti D, Rollins J A, Harmon P F. Evidence for morphological, vegetative, genetic, and mating-type diversity inSclerotiniahomoeocarpa[J]. Phytopathology, 2012, 102(5): 506-518.

(责任编辑:杨明丽)

A simplified method to prevent contamination and drying of the medium plate

Yang Ping, Pu Xiangjun, Shi Tingting, Wang Zhongwen, Zhang Juncheng

(CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning530004,China)

Contamination of undesired microbe and drying of medium were often encountered in routine culture of plant pathogen. A simplified and effective method was introduced to resolve the problem. The main point of the method was that the medium plate was placed in a sealed common plastic storage box, and was then cultured in an incubator. The method is suitable especially for the culture operation which will take a long time. Apart from the plate culture, the method might also be used for culture in other forms to prevent moisture loss and contamination.

pathogen; culture; contamination; drying

2016-04-20

2016-05-29

广西自然科学基金(2011GXNSFA018068);教育发展资金(创优)区双创教育示范专业-植物保护(T3310098003)

Q 939.95

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.021

* 通信作者 E-mail: jczhang@gxu.edu.cn